VEGFCsiRNA对人肺癌细胞A549生物学行为的影响

　　【摘要】 目的 初步探讨靶向VEGFC基因的siRNA转染肺癌细胞A549后对其生物学行为的影响。方法 构建靶向VEGFC的siRNA表达质粒并转染A549细胞，免疫印迹法检测蛋白的表达水平，Transwell小室检测细胞体外侵袭能力，MTT法检测细胞增殖活性。结果 成功构建靶向VEGFC的siRNA表达质粒。VEGFCsiRNA转染后的细胞侵袭能力较对照组减弱，生长抑制率明显高于阴性对照组(P<0.01)，且表现出时间依赖性。结论 靶向VEGFC的siRNA转染后可以显著降低A549细胞侵袭能力，抑制肿瘤细胞增殖。

　　【关键词】 VEGFCsiRNA;肺癌细胞A549;基因沉默;生物学行为

　　Silence of VEGFC gene to affect the biological behaviors

　　in human lung adenocarcinoma cell

　　Zhang Junneng,Zhang Tie

　　【Abstract】Objective To study the effect of small interference RNA expression vector of VEGFC on the biological behaviors in human lung adenocarcinoma cell line A549.Methods We constructed the eukaryotic expression vector of small hairpin RNA (shRNA) targeting VEGFC gene, and transfected A549 cells. After the efficiency of inhibition was verified by western blot, The invasion ability was detected by Transwell cell culture chamber，the proliferation activity was determined by MTT.Results The siRNA vector was successfully constructed.Compared with the negative control group, the invasion ability weakened obviously,the inhibiting ratio of proliferation significantly increased depending upon the transfecting time.Conclusion The shRNA vectors targeting VEGFC gene could efficiently inhibit the invasion and proliferation ability.

　　【Key words】VEGFC; lung adenocarcinoma cell line A549; Gene silence; biological behaviors

　　RNA干扰(RNAi) 是近年来发展起来的新技术，已成为分子生物学研究中最为活跃的热点之一，利用RNAi 技术进行肿瘤基因治疗的研究是现在的焦点。血管内皮生长因子C (vascular endothelial growth factorC,VEGFC)是VEGF家族的新成员，表达于多种肿瘤细胞表面，肿瘤细胞分泌的VEGFC通过自分泌机制与自身受体结合，调控下游基因的表达而促进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移[2]。本研究构建针对VEGFC的siRNA，转染人肺腺癌细胞A549，检测肿瘤细胞侵袭、增殖的情况，以期为肺癌基因治疗提供新策略和实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 人肺腺癌细胞株A549由中国典型培养物保藏中心提供。RPMI1640培养基购自Gibco公司;U6 RNA聚合酶启动子的空载质粒pSilencer2.1U6 neo购自美国Ambion公司;限制性内切酶购自Takara公司;T4连接酶和MLV逆转录酶购自Promega公司;总RNA提取Trizol试剂盒、脂质体转染试剂Lipofectamine 2000、dNTP 和oligoDT为Invetrogen产品;兔抗人hVEGF多克隆抗体均购自美国Santa Cruz 公司;辣根标记山羊抗兔IgG购自中杉金桥公司;质粒小提试剂盒购自博大泰克公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 siRNA的设计 根据Ambion公司网站上关于siRNA靶序列选定的标准及文献报道，我们设计了针对VEGFC基因序列5′GATCCGATAATGAG TGGAGAAAGATTCAAGAGATCTTTCTCCACTCATTA TCTTTTTTGGAAA3′，并经过BLAST比对，以避免与其他的内源性基因有同源性。

　　1.2.2 干扰RNA表达质粒的构建 pSilencer2.1U6 neo的克隆位点上由对应的BamhI和HindIII酶切位点，将质粒双酶切回收后，加入退好火的寡核苷酸片段，T4连接酶连接。将连接产物电转感受态细胞DH5α，然后提取质粒测序鉴定。最终构建成功的质粒分别命名为U6siVEGF。

　　1.2.3 细胞培养和转染 A549细胞接种于六孔板，在含有10%胎牛血清，5%双抗的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2 饱和湿度条件下培养。待细胞密度达95%以上时，换无血清和双抗的RPMI1640培养基。按照Lipofectamine 2000产品使用说明书进行转染。转染6 h后，换液补充含胎牛血清和双抗的全培养基，继续培养收样。

　　1.2.4 Western blot 分析 将转染48 h后所收的细胞样品，用预冷的PBS洗过之后，加入细胞裂解液，超声仪破碎细胞，制样。SDSPAGE分离后，转到NC膜上。封闭，洗涤，一抗孵育，洗涤，二抗孵育后，加发光底物，X胶片压片检测。最后以imageproplus4.5图像分析系统测定各条带灰度值，以此反映蛋白表达水平。

　　1.2.5 A549细胞体外侵袭能力的测定 在Transwell小室(Corning Costar公司)中进行。以0.5μl含5μgFN的PBS处理Transwell小室的聚碳酸滤膜的下表面，Mrtrigel用0.1%小牛血清的RPMI1640培养基稀释成100 mg/L，加入滤膜上表面。将转染48 h的细胞消化后重悬于含0.1%BSA的RPMI1640培养基中，取1×105个/ml细胞100μl加入至上室，600μl 0.1%小牛血清培养基加入下室。常规培养24 h后，行HE染色。去除滤膜上层细胞，镜下计数滤膜下表面细胞数，随机计数5个视野中的细胞数目，每个标本重复3次，以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。

　　1.2.6 MTT法检测细胞增殖活性 将处于对数生长期的细胞以胰酶消化制成单细胞悬液，每孔1×104个细胞接种于96孔板，每组设5个复孔，并设调零组。转染24、48、72 h后，每孔加入20μl MTT溶液(5g/L)，常规培养4 h，弃去培养基，每孔加入150μl的DMSO，室温下避光振荡10 min。用酶标仪测定490 nm处吸光度A值。细胞生长抑制率(%)=1实验组A均值/对照组A均值×100 %。

　　1.3 统计学处理 所得数据均以x±s表示，采用单因素方差分析，通过软件SPSS13.0完成，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 VEGFCsiRNA干扰效果 Westernblot检测结果显示A549细胞中VEGFC基因是高表达的。转染48 h后VEGFC的表达与对照组比较，灰度值明显下降，其抑制率为(72.57±13.52)%。

　　2.2 A549细胞体外侵袭能力的测定 siRNA转染A549细胞48 h后使A549细胞侵袭重建基底膜能力受到显著的抑制，侵袭至Transwell小室滤膜下表面的细胞数siVEGFC组(42.76±2.87)显著低于空白对照组(60.67±5.71)和阴性对照组(61.00±2.48)(P<0.01)。

　　2.3 A549细胞的增殖活性 转染后24、48、72h ，siVEGFC 组的细胞生长抑制率明显高于阴性对照组(P<0.05)，且表现出时间依赖性，见表1。表1 siRNA对细胞增殖功能的影响

　　3 讨论

　　RNA干扰(RNAi)是近几年发展起来的一种新兴的基因沉默技术,它是由双链RNA介导的靶向基因序列特异性转录后沉默机制。目前，RNAi技术已被广泛应用于各种肿瘤研究，结果发现其可特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，从而抑制肿瘤的发生、发展。 RNAi技术在肺癌治疗方面也取得了一些突破性进展，其可直接作用于肺癌的靶向基因，也可通过抑制肿瘤血管新生间接治疗肺癌。

　　肿瘤的生长转移和预后受多种因素的影响，其中较为重要的因素之一是肿瘤组织内新血管生成。研究表明，肿瘤血管的形成依赖于多种相关因子的诱导和调节，血管内皮生长因子C (hVEGFC)是诱导肿瘤血管生成作用最强、特异性最高的血管生成因子之一，在人体许多肿瘤中均高表达，并且VEGF及其受体的表达有随肿瘤恶性程度的增加而递增的趋势。已有研究表明RNA干扰VEGFC 基因表达下调的同时诱导CerbB2 和bcl2 等基因表达的下调。VEGFC 信号传导通路中MEK/ERK 和PI3激酶/Akt 途径与酪氨酸激酶信号共通路，共同激活下游信号的传导。siRNA沉默VEGFC 基因的同时，可能也抑制其相关及下游基因，从而诱导细胞凋亡。

　　本研究构建了针对VEGFC的siRNA，转染人肺腺癌细胞A549，检测肿瘤细胞侵袭、增殖的情况。实验结果显示，A549转染 VEGFCsiRNA 48h后VEGFC的蛋白表达量明显下降，其抑制率为(72.57±13.52)%，这说明成功构建了靶向VEGFC的siRNA表达质粒;VEGFCsiRNA转染A549细胞48次h后使A549细胞体外侵袭能力受到显著的抑制，siVEGFC组(42.76±2.87)显著低于空白对照组(60.67±5.71)和阴性对照组(61.00±2.48)(P<0.01);A549转染 VEGFCsiRNA后24、48、72 h，siVEGFC组的细胞生长抑制率明显高于阴性对照组(P<0.05)，且表现出时间依赖性。

　　目前RNAi也面临着许多挑战，如对基因沉默的不完全性，可能与瘤细胞对RNAi的抵抗性有关。已在不同类型的癌细胞中发现，miRNA以及相关酶表达发生改变，可能会导致siRNA在肿瘤细胞中作用机制发生改变，癌基因的缺失可能导致siRNA失去其有效性。另外，尽管RNAi比其他的基因沉默方式更有效，RNAi只是使异常基因表达下调，并不能彻底消除异常基因。基因表达的下调能充分改善某些临床相关症状，但这并不是治愈。而对恶性肿瘤治疗的理想目标，则是要求彻底消除肿瘤细胞。总之，本研究证实了应用靶向VEGFC的RNA干扰技术在肺癌治疗中的前期可行性，为肺癌的分子治疗提供了一个新的思路。

　　【参考文献】

　　1 Ray K M L, Paul A W. RNA interference: from gene silencing to genespecific therapeutics[J]. Pharmacol Ther,2005,107:222239.

　　2 Robert R J. Vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling in tumor progression[J].Crit Rev Oncol Hematol,2007,62:179213.

　　3 Wee B T, Shan J, Yong Z. Quantumdot based nanoparticles for targeted silencing of HER2/neu gene via RNA interference[J].Biomaterials,2007,28:15651571.

　　4 Jen L S,Pan C Y,Jin Y S,et al. The VEGFC/Flt4 axis promotes invasion and metastasis of cancer cells[J].Cancer Cell, 2006, 9:209223.

　　5 Shizhen E W, Archana N, Marianela P T,et al. HER2 kinase domain mutation results in constitutive phosphorylation and activation of HER2 and EGFR and resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors[J].Cancer Cell, 2006,10:2538.

　　6 Oldenhuis C N A M, Oosting S F, Gietema J A,et al. Prognostic versus predictive value of biomarkers in oncology[J]. Eur J Cancer,2008,44:946953.