中国人家族性早发2型糖尿病/MODY家系NF1alpha基因缺陷的分子筛查

　　【摘要】 目的 通过对疑为MODY的中国人家族性早发2型糖尿病患者HNF1alpha基因分子筛查，探求该基因的分子缺陷是否为中国人家族性早发2型糖尿病/MODY家系的主要致病基因;同时期望能寻找到HNF1alpha致病基因新的突变位点。方法 对7个疑为MODY的中国人早发2型糖尿病家系先证者进行HNF1alpha全基因外显子的突变筛查——DNA直接测序以明确具体的核酸突变及其编码的氨基酸突变。对测序明确的突变类型用DHPLC方法筛查出标准突变峰型，并用同样的条件对家系中其他成员进行HNF1alpha相关位点基因扫描。结果 在7个家系先证者中分别发现HNF1alpha基因编码区的Leu17Leu同义变异，I27L错义变异，E105V、E73K和G184W错义变异，Leu459Leu同义变异， Gln486Gln同义变异，S487N和S574G错义变异。家族性早发2型糖尿病人群I27L各等位基因频率分别为A 0.70，C 0.30，其中4例I27L位点的CC基因型纯合变异均为2型糖尿病患者，但家系内不同基因型频率关联分析无统计学意义(0.25

　　【关键词】 MODY 糖尿病家系,HNF1alpha基因,DHPLC,2型糖尿病

　　Molecular Scanning on Hepatocyte Nuclear Factor1 Alpha(HNF1alpha) Gene in

　　Chinese Familial Earlyonset Type 2 Diabetes Mellitus/MODY Pedigrees

　　Cao Xu

　　Department of Endocrinology, Sichuan Provencial People’s Hospital, Chengdu 610041

　　【Abstract】Objective To explore whether HNF1alpha gene mutations are the main genetic disorders which could cause the diseases in Chinese familial earlyonset type 2 diabetes mellitus/MODY pedigrees.Methods Direct sequencing of all the exons of HNF1alpha gene was given to 7 probands of Chinese earlyonset type 2 diabetes pedigrees who were suspected to be MODY. Denaturing highperformance liquid chromatograph (DHPLC) was used to filtrate the standard pictures for the mutations known after HNF1alpha gene sequencing. Using the same conditions of DHPLC to scan the same mutation in the rest members of the 7 pedigrees.Results We found Leu17Leu, Leu459Leu and Gln486Gln with same sense mutations and I27L, E105G, E73K, G184W, S487N and S574G with mistake sense mutations in 7 probands. The I27L polymorphism allelic frequency in Chinese familial earlyonset type 2 diabetes mellitus were A 0.70, C 0.30 respectively, and all of four CC genotype subjects were diabetesmellitus in 2 pedigrees, but the genotype frequency association analysis in all members of pedigrees had no difference between each other (0.25

　　【Key words】MODY; diabetic pedigree; HNF1alpha gene; DHPLC; type 2 diabetes mellitus

　　MODY(maturity onset diabetes mellitus in youth)是特殊类型糖尿病中的一种异质性单基因疾病。至今已发现6个比较明确的MODY基因：肝细胞核因子4α(HNF4α，MODY1)基因、葡萄糖激酶(GCK, MODY2)基因、肝细胞核因子1α(HNF1α，MODY3)基因、胰岛素启动子因子(IPFI，MODY4)基因、肝细胞核因子1β(HNF1β，MODY5)和神经元分化因子(NeuroD1，MODY6)基因。以上基因均表达于胰岛β细胞，其中任一基因突变都可以导致β细胞功能缺陷，从而引发糖尿病。

　　MODY3是最为常见的MODY类型，但因人种不同其相对患病率占MODY的13%～64%不等[1]。目前HNF1alpha基因定位在12q24.2，至今已在欧洲、中国、日本、非洲和美国印第安人中共发现了120多种HNF1alpha基因突变。

　　Ellard对116个英国糖尿病家系进行MODY3相关基因检测，发现了65种不同突变，其中有22个家系的发病是由HNF1alpha/MODY3基因外显子4的 P291fsinsC突变引起[2]。在德国，Kaisaki等对25名诊断为2型糖尿病，无血缘关系，35岁前起病，家族中一级亲属有NIDDM患者的德国白种人患者进行HNF1alpha/MODY3基因10个外显子和两侧的内含子的基因变异筛查显示，其中9人有基因变异(占36%)，并且有3种突变均为外显子4的 Pro291fsinsC[3]。因此推断在高加索白种人中HNF1alpha基因突变是MODY患者常见的致病基因，并且外显子4是突变热点。

　　为了进一步证实HNF1alpha基因在家族性早发2型糖尿病致病中起何种作用及MODY3基因突变的分布是否存在种族差异，本研究以7个疑为MODY的早发2型糖尿病患者的家系作为研究对象，进行HNF1alpha全基因外显子的突变筛查，以期能发现新的MODY3基因致病位点。

　　1 对象和方法

　　1.1 对象 家族性早发2型糖尿病/MODY家系(earlyonset diabetic pedigrees，Earlyonset DP)，家系成员共84人，符合下列特征的家系先证者共7人：①中国籍，汉族;②先证者初次诊断2型糖尿病、IGT或IFG(按照1999年WHO标准)时的年龄<35岁，或者先证者为GDM患者;③家系中连续3代均有2型糖尿病、IGT或IFG患者;④起病及病程中无酮症倾向。

　　入选对象共84人，其中男33人，女性51人;糖尿病35人，IFG3人，IGT12人，NGT34人。平均年龄(42.91±18.97)岁。其中糖尿病患者病程平均(2.80±5.60)年，在试验过程中接受饮食控制、运动疗法和药物或胰岛素治疗。有高血压、冠心病、血脂异常及糖尿病慢性并发症患者同时接受相应治疗。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 临床体征资料和糖、脂代谢生化资料的采集 包括性别、年龄、病程、身高、体重、BMI、WHR、血压、75gOGTT及胰岛素释放试验、TG、TC、HDL、部分成员C肽释放试验和HbA1c。

　　1.2.2 DNA制备 DNA从外周血用酚氯仿法提取。

　　1.2.3 HNF1alpha基因目标片段的扩增 对7个家系先证者HNF1alpha基因的启动子和10个外显子进行目标条带的PCR扩增(引物序列见表1)。

　　PCR扩增条件：Promoter、exon1至exon8、exon10的条件为：预变性95℃ 5 min，然后进入主循环：变性94℃ 30 s，退火60℃30 s，延伸72℃ 30 s，共30个循环，末次延伸72℃ 10 min。Promoter、Exon1、3、4、6、7、10的PCR反应体系：10×PCR Buffer 5 μl，MgCl2 3 μl, dNTP 4 μl, Primer R 0.8 μl，Primer F 0.8 μl，ddH2O 35.15 μl，Taq酶 0.25μl, template1 μl。Exon 2和Exon 8的PCR反应体系：10×PCR Buffer 5 μl，MgCl2 3 μl, dNTP 4 μl, Primer R 0.6 μl, Primer F 0.6 μl, ddH2O 35.55 μl, Taq酶0.25 μl, template 1 μl。Exon 5的PCR反应体系：表1 HNF1alpha引物序列

　　10×PCR Buffer 5 μl，MgCl2 3 μl, dNTP 4 μl, Primer R 0.4 μl, Primer F 0.4 μl, ddH2O 35.95 μl, Taq酶 0.25 μl, template 1 μl。Exon9的条件：96℃预变性4 min，后于80℃时加入LATaq酶;94℃变性30 s，68℃59℃每隔1℃降低一次退火温度，退火30 s， 72℃延伸30 s，共10个循环;然后进入主循环：变性94℃ 30 s，退火54℃30 s，延伸72℃ 30 s，共30个循环，末次延伸72℃ 5 min。Exon 9的PCR反应体系：2×GC Buffer 25μl，dNTP 8μl，Primer R 1μl，Primer F 1μl，ddH2O 12.5μl，template 2μl，LATaq 0.5μl。

　　HNF1alpha基因目标外显子片段长度的鉴定：PCR产物5 μl+6×Loading Buffer 1 μl，加入2%琼脂糖电泳板中，在0.5×TAE缓冲液中，100伏的恒压下电泳1h。溴乙啶染色30min，在紫外光(310 nm)下鉴定是否有目标产物条带。

　　1.2.4 DNA序列测定 用ExTaq酶按照上述同样的PCR扩增条件和体系，扩增HNF1alpha全基因启动子和10个外显子。采用50～100 μl PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物仍然用2%琼脂糖电泳、显影鉴定。如果显示为单一、清晰、明亮目标条带，则直接送天津宝生物公司用ABI Prism377型自动测序仪进行DNA测序。

　　1.2.5 标准突变峰型的筛查 根据家系先证者DNA测序结果，对发现杂合突变的个体，用变性高效液相色谱法(denaturing highperformance liquid chromatograph，DHPLC)筛查出标准突变峰型，并以此为标准条件，同样用DHPLC方法对家系中其他成员、无血缘关系散发的迟发起病2型糖尿病患者群体和正常人群进行HNF1alpha相关位点基因扫描。

　　1.3 统计学方法 采用Windows SPSS 11.5分析软件。各组间临床生化指标采用方差分析;家族性早发2型糖尿病/MODY家系组各基因型频率比较采用家系内关联分析。

　　2 结果

　　2.1 PCR扩增HNF1alpha各外显子目标条带在琼脂糖电泳后紫外光下显影结果见图1。

　　2.2 在7个早发2型糖尿病/MODY家系先证者中发现的突变

　　1)编码区域突变。见表2。表2 在7个早发2型糖尿病/MODY家系先证者中发现的HNF1alpha基因编码区突变 2)非编码区域突变。见表3。表3 在7个早发2型糖尿病/MODY家系先证者中发现的HNF1alpha基因非编码区突变

　　2.3 各编码区的突变位点测序图 见封三图2。

　　2.4 标准突变峰型的筛查结果

　　1)HNF1alpha外显子1 野生型图形。见图3。

　　2)包含HNF1alpha外显子1 I27L杂合错义突变的图形。见图4(A～D)。图A、B、C、D虽然峰型有所差别，但其代表的样品DNA直接测序均可见I27L杂合错义突变。峰型出现差异的原因是不同样品除了有I27L杂合错义突变外，还各自在内含子部分存在其他不同的杂合变异。因此可以将其均作为标准峰型，推断是否存在I27L杂合错义突变。

　　图3 HNF1alpha外显子1 野生型图形

　　图4 包含HNF1alpha外显子1 I27L杂合错义突变的图形

　　2.5 HNF1alpha基因的I27L错义突变在家系中各成员的分布 见图5。

　　图5 HNF1alpha基因的I27L错义突变

　　在家系中各成员的分布

　　图中数字和字母的含义：①符号右上角的数值——代表先证者起病的年龄;②符号下角的字母AA——代表I27L位点基因型为AA;③符号下角的字母AC——代表I27L位点基因型为AC;④符号下角的字母CC——代表I27L位点基因型为CC。箭头所指为先证者。

　　2.6 I27L变异与糖尿病有相关性 仅在家系A发现I27L变异与糖尿病有相关性，成员临床资料见表4。

　　2.7 I27L不同基因型成员的临床资料比较 见表5。

　　2.8 基因型与临床表现的相关性 由上述结果可以看出，尽管AA基因型和AC基因型个体的各项临床指标无明显差异，但CC基因型组的年龄、WHR、HbA1c、FPG、TG、TC 、HOMAIR均明显高于AA基因型组和AC基因型组(P<0.05)，而HOMAIS则低于AA基因型组和AC基因型组，提示CC基因型组个体有着比AA基因型组和AC基因型组更为严重的糖、脂代谢紊乱，且具有更高的胰岛素抵抗和更低的细胞功能。对家系中PT2DM、PIGR和PNGT 3个亚组进行基因型和临床表现间关系的分析显示，CC基因型群体比AC基因型和AA基因型群体有更明显的胰岛素抵抗(HOMAIR分别为CC：24.66±20.59 VS AA：4.17±3.42 VS AC：6.23±3.66，P<0.05)，细胞功能在三者间无明显差异。而AC基因型和AA基因型群体间临床表型上亦无明显差异。AC基因型个体120 min胰岛素水平比AA基因型个体明显低(AA：77.12±47.34 mU/L VS AC：40.95±21.03 mU/L，P<0.05)。家族性早发2型糖尿病/MODY家系组内P T2DM、PIGR和PNGT3个亚组的I27L位点基因型(AA、CC、AC)频率进行关联分析，结果显示3组间基因型频率差异无统计学意义(0.25

　　3 讨论

　　MODY3基因——HNF1alpha是一种组织特异性且包含同源结构的转录因子，属于HNF1的类固醇激素超家族。其不仅可以通过胰岛素启动子调控胰岛素表达[4]，而且也是葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)和左旋丙酮酸激酶(PK)的转录激活因子。故HNF1alpha基因突变可使胰岛素分泌受损。此外，肝脏糖酵解基因的转录活化要依赖于葡萄糖和胰岛素的作用，所以HNF1alpha有可能也直接影响肝脏葡萄糖的代谢。HNF1alpha中所有功能域的突变都可导致MODY3的发生，这类突变有可能是通过单倍型缺陷或显性失活机制造成有功能转录因子数量的改变而致病。由于HNF1alpha表4 家系A的临床资料表5 I27L不同基因型成员的临床资料比较的纯合二聚体形成有活性的转录因子，突变缺损的HNF1alpha[5]可以和野生型的HNF1alpha蛋白结合成无功能的二聚体，如果突变的HNF1alpha基因表达，照此计算，HNF1alpha二聚体的转录功能可能削减2/3[6]。

　　我们对有7个早发糖尿病患者的家系的研究显示：其先证者发病年龄早，平均为(26.14±4.30);胰岛β细胞的功能有所减退，特别是餐后2 h的胰岛素分泌量明显减少;无明显高血压、高脂血症等其他代谢紊乱的表现;遗传倾向明显，家族聚集性强，三代都有患者。从临床表现上分析总体符合MODY标准。对他们进行HNF1alpha全基因外显子的DNA直接测序发现，大于50%的个体出现Leu17Leu、I27L、Leu459Leu、Gln486Gln、S487N、S574G等6种编码区基因变异。用DHPLC方法对家系内各成员的I27L (ATC→CTC)位点进行扫描，其等位基因A的频率为0.70，等位基因C的频率为0.30。Pruhova等[7]报道该位点在捷克斯洛伐克MODY家系人群中等位基因A的频率为0.64，等位基因C的频率为0.36;Maggie等[8]报道该位点在中国香港地区早发2型糖尿病(初次诊断糖尿病年龄小于40岁)人群中等位基因A的频率为0.57，等位基因C的频率为0.43[8]。因此需要进一步对大规模人群进行该位点的基因扫描，从而证明该位点是否和家族性早发2型糖尿病相关。

　　我们的研究仅在家系A发现I27L变异与2型糖尿病发病有明显的关系，即该家系的2型糖尿病患者均为I27L位点的AC基因型或CC基因型，但由于该家系成员较少，无法证明家系中无I27L位点变异的个体一定为NGT。对Earlyonset DP组中各成员按I27L基因型不同，分为AA型、CC型、AC型3个亚组，其临床特征比较显示：CC型个体有着比AA、AC型更为严重的糖、脂代谢紊乱(P<0.05)，并且CC型个体均为2型糖尿病患者。而AA型和AC型两种基因型在家系中2型糖尿病患者、IGR个体和NGT个体均可见到，对家系内PT2DM亚组、PIGR亚组和PNGT亚组作AA、AC、CC基因型的家系内关联分析，未见明显的差异(0.25

　　多态信息含量(PIC)是度量群体杂和度的方法，Gill等将PIC≥0.7的座位作为高鉴别能力的遗传标志物[9]。而本研究显示HNF1alpha基因I27L位点的PIC值(分别为0.55和0.20)均小于0.7，尚不能作为家族性早发2型糖尿病的遗传标志物。

　　本研究还在E家系发现E73K、E105G两种杂合错义突变;B家系发现G184W杂合错义突变，由于研究仅局限于家系先证者，故目前无法肯定判断其是否为存在共分离现象的致病突变，因此这些突变是否具有临床意义，或者仅仅是基因多态性还需要进一步研究。

　　在白种人位于外显子4的P291fsinsC突变占HNF1alpha基因突变的20%～25%，这个突变热点在3个德国糖尿病家系[3]，7个英国糖尿病家系[10]和4个芬兰糖尿病家系[11]中得以证实。但在本研究的7个早发2型糖尿病家系的先证者中，HNF1alpha基因的外显子4均未发现任何突变，而是在其外显子1、7发现多个SNP。可见，P291fsinsC虽然是突变热点，但仍然存在种族异质性。

　　除了在HNF1alpha编码区发现变异外，我们还在非编码区发现IVS1+1G→T、IVS142A→G、IVS251A→T、IVS223C→T、IVS7+7G→A、IVS7+2T→A、IVS924T→C(部分位点变异的等位基因频率已分别由Kazuya[12]和Maggie[8]相继报道)等变异。尽管大多数基因编码区和拼接区突变都会使该基因功能产生异常，但基因产物功能的异常并不仅仅局限于基因编码区和拼接区突变所致，其他部位的突变或变异也可能会影响基因表达。越来越多的研究显示，一些内含子位点的SNP也会对基因的结构和功能产生影响。因此，可以对早发2型糖尿病家系中有上述SNP位点和没有上述SNP位点的青少年做追踪随访观察，对他们是否以后患糖尿病的情况进行统计，从而判断这些SNP在遗传缺陷与HNF1alpha基因表达调控方面是否存在相关性。

　　【参考文献】

　　1 Massa O, Meschi F, CuestaMunoz A, et al. High prevalence of glucokinase mutations in Italian children with MODY:Influence on glucose tolerance, firstphase insulin response, insulin sensitivity and BMI[J]. Diabetologia, 2001，44:898905.

　　2 Ellard S. Hepatocyte nuclear factor 1 alpha (HNF1 alpha) mutation in maturi

　　tyonset diabetes of the young[J].Hum Mutat,2000,16(5):377385.

　　3 Kaisaki P J, Menzel R, Linder T, et al. Mutations in the hepatocyte nuclear factor1β gene in MODY and earlyonset NIDDM: evidence for a mutational hotspot in exon4[J].Diabetes,1997,46:528535.

　　4 Okita K, Yang Q, Yamagata K, et al. Human insulin gene is a target gene of hepatocyte nuclear factor1 alpha(HNF1alpha) and HNF1beta[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1999,263:566569.

　　5 Hattersley A T. Maturityonset diabetes of the young:Clinical heterogeneity explained by genetic heterogeneity[J].Diabetes Med, 1998,15:1524.

　　6 Lazzaro D, De Simone V, De Magistris, et al. LFB1 and LFB3 homeoproteins are sequentially expressed during kidney development[J]. Development, 1999,114:469479.

　　7 Pruhova S,Lebl J.Genetic epidemiology of MODY in the Czech republic: new mutations in the MODY genes HNF41, GCK, and HNF1[J].Diabetologia, 2003,46:291295.

　　8 Cockburnt M C Y，Lindnert T H.Molecualr genetics of diabetes mellitus in Chinese subjects: indetification of mutations in glucokinase and hepatocyte nuclear factor1 genes in patients with earlyonset Type 2 diabetes mellitus/MODY[J].Diabetic Medicine，1999,16:956963.

　　9 Gill P.A new method of STR interpretation using inferential logicdevelopment of a Criminalintelligence database[J].Int J Leg Med，1996,109:14.

　　10Fraying T M, Bulman M P, Ellard S, et al. Mutations in the hepatocyte nuclear factor1 gene are a common cause of maturityonset diabetes of the young in the U.K[J].Diabetes,1997,46:720725.

　　11Glucksmann M A, Lehto M, Tayber O, et al. Novel mutations and a mutational hotspot in the MODY3 gene[J].Diabetes,1997,46:10811086.

　　12Kazuya Y, Naohisa O, Pamela J K, et al. Mutations in the hepatocyte nuclear factor1β gene in maturityonset diabetes of the young(MODY3) [J]. Nature,1996,384:455458.

　　作者：曹旭 田浩明 作者单位：610071 四川成都，四川省人民医院内分泌科(曹旭);610041四川成都，四川大学华西医院(田浩明)

　　【摘要】 目的 通过对疑为MODY的中国人家族性早发2型糖尿病患者HNF1alpha基因分子筛查，探求该基因的分子缺陷是否为中国人家族性早发2型糖尿病/MODY家系的主要致病基因;同时期望能寻找到HNF1alpha致病基因新的突变位点。方法 对7个疑为MODY的中国人早发2型糖尿病家系先证者进行HNF1alpha全基因外显子的突变筛查——DNA直接测序以明确具体的核酸突变及其编码的氨基酸突变。对测序明确的突变类型用DHPLC方法筛查出标准突变峰型，并用同样的条件对家系中其他成员进行HNF1alpha相关位点基因扫描。结果 在7个家系先证者中分别发现HNF1alpha基因编码区的Leu17Leu同义变异，I27L错义变异，E105V、E73K和G184W错义变异，Leu459Leu同义变异， Gln486Gln同义变异，S487N和S574G错义变异。家族性早发2型糖尿病人群I27L各等位基因频率分别为A 0.70，C 0.30，其中4例I27L位点的CC基因型纯合变异均为2型糖尿病患者，但家系内不同基因型频率关联分析无统计学意义(0.25

　　【关键词】 MODY 糖尿病家系;HNF1alpha基因;DHPLC;2型糖尿病

　　Molecular Scanning on Hepatocyte Nuclear Factor1 Alpha(HNF1alpha) Gene in

　　Chinese Familial Earlyonset Type 2 Diabetes Mellitus/MODY Pedigrees

　　Cao Xu

　　Department of Endocrinology, Sichuan Provencial People’s Hospital, Chengdu 610041

　　【Abstract】Objective To explore whether HNF1alpha gene mutations are the main genetic disorders which could cause the diseases in Chinese familial earlyonset type 2 diabetes mellitus/MODY pedigrees.Methods Direct sequencing of all the exons of HNF1alpha gene was given to 7 probands of Chinese earlyonset type 2 diabetes pedigrees who were suspected to be MODY. Denaturing highperformance liquid chromatograph (DHPLC) was used to filtrate the standard pictures for the mutations known after HNF1alpha gene sequencing. Using the same conditions of DHPLC to scan the same mutation in the rest members of the 7 pedigrees.Results We found Leu17Leu, Leu459Leu and Gln486Gln with same sense mutations and I27L, E105G, E73K, G184W, S487N and S574G with mistake sense mutations in 7 probands. The I27L polymorphism allelic frequency in Chinese familial earlyonset type 2 diabetes mellitus were A 0.70, C 0.30 respectively, and all of four CC genotype subjects were diabetesmellitus in 2 pedigrees, but the genotype frequency association analysis in all members of pedigrees had no difference between each other (0.25

　　【Key words】MODY; diabetic pedigree; HNF1alpha gene; DHPLC; type 2 diabetes mellitus

　　MODY(maturity onset diabetes mellitus in youth)是特殊类型糖尿病中的一种异质性单基因疾病。至今已发现6个比较明确的MODY基因：肝细胞核因子4α(HNF4α，MODY1)基因、葡萄糖激酶(GCK, MODY2)基因、肝细胞核因子1α(HNF1α，MODY3)基因、胰岛素启动子因子(IPFI，MODY4)基因、肝细胞核因子1β(HNF1β，MODY5)和神经元分化因子(NeuroD1，MODY6)基因。以上基因均表达于胰岛β细胞，其中任一基因突变都可以导致β细胞功能缺陷，从而引发糖尿病。

　　MODY3是最为常见的MODY类型，但因人种不同其相对患病率占MODY的13%～64%不等[1]。目前HNF1alpha基因定位在12q24.2，至今已在欧洲、中国、日本、非洲和美国印第安人中共发现了120多种HNF1alpha基因突变。

　　Ellard对116个英国糖尿病家系进行MODY3相关基因检测，发现了65种不同突变，其中有22个家系的发病是由HNF1alpha/MODY3基因外显子4的 P291fsinsC突变引起[2]。在德国，Kaisaki等对25名诊断为2型糖尿病，无血缘关系，35岁前起病，家族中一级亲属有NIDDM患者的德国白种人患者进行HNF1alpha/MODY3基因10个外显子和两侧的内含子的基因变异筛查显示，其中9人有基因变异(占36%)，并且有3种突变均为外显子4的 Pro291fsinsC[3]。因此推断在高加索白种人中HNF1alpha基因突变是MODY患者常见的致病基因，并且外显子4是突变热点。

　　为了进一步证实HNF1alpha基因在家族性早发2型糖尿病致病中起何种作用及MODY3基因突变的分布是否存在种族差异，本研究以7个疑为MODY的早发2型糖尿病患者的家系作为研究对象，进行HNF1alpha全基因外显子的突变筛查，以期能发现新的MODY3基因致病位点。

　　1 对象和方法

　　1.1 对象 家族性早发2型糖尿病/MODY家系(earlyonset diabetic pedigrees，Earlyonset DP)，家系成员共84人，符合下列特征的家系先证者共7人：①中国籍，汉族;②先证者初次诊断2型糖尿病、IGT或IFG(按照1999年WHO标准)时的年龄<35岁，或者先证者为GDM患者;③家系中连续3代均有2型糖尿病、IGT或IFG患者;④起病及病程中无酮症倾向。

　　入选对象共84人，其中男33人，女性51人;糖尿病35人，IFG3人，IGT12人，NGT34人。平均年龄(42.91±18.97)岁。其中糖尿病患者病程平均(2.80±5.60)年，在试验过程中接受饮食控制、运动疗法和药物或胰岛素治疗。有高血压、冠心病、血脂异常及糖尿病慢性并发症患者同时接受相应治疗。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 临床体征资料和糖、脂代谢生化资料的采集 包括性别、年龄、病程、身高、体重、BMI、WHR、血压、75gOGTT及胰岛素释放试验、TG、TC、HDL、部分成员C肽释放试验和HbA1c。

　　1.2.2 DNA制备 DNA从外周血用酚氯仿法提取。

　　1.2.3 HNF1alpha基因目标片段的扩增 对7个家系先证者HNF1alpha基因的启动子和10个外显子进行目标条带的PCR扩增(引物序列见表1)。

　　PCR扩增条件：Promoter、exon1至exon8、exon10的条件为：预变性95℃ 5 min，然后进入主循环：变性94℃ 30 s，退火60℃30 s，延伸72℃ 30 s，共30个循环，末次延伸72℃ 10 min。Promoter、Exon1、3、4、6、7、10的PCR反应体系：10×PCR Buffer 5 μl，MgCl2 3 μl, dNTP 4 μl, Primer R 0.8 μl，Primer F 0.8 μl，ddH2O 35.15 μl，Taq酶 0.25μl, template1 μl。Exon 2和Exon 8的PCR反应体系：10×PCR Buffer 5 μl，MgCl2 3 μl, dNTP 4 μl, Primer R 0.6 μl, Primer F 0.6 μl, ddH2O 35.55 μl, Taq酶0.25 μl, template 1 μl。Exon 5的PCR反应体系：表1 HNF1alpha引物序列

　　10×PCR Buffer 5 μl，MgCl2 3 μl, dNTP 4 μl, Primer R 0.4 μl, Primer F 0.4 μl, ddH2O 35.95 μl, Taq酶 0.25 μl, template 1 μl。Exon9的条件：96℃预变性4 min，后于80℃时加入LATaq酶;94℃变性30 s，68℃59℃每隔1℃降低一次退火温度，退火30 s， 72℃延伸30 s，共10个循环;然后进入主循环：变性94℃ 30 s，退火54℃30 s，延伸72℃ 30 s，共30个循环，末次延伸72℃ 5 min。Exon 9的PCR反应体系：2×GC Buffer 25μl，dNTP 8μl，Primer R 1μl，Primer F 1μl，ddH2O 12.5μl，template 2μl，LATaq 0.5μl。

　　HNF1alpha基因目标外显子片段长度的鉴定：PCR产物5 μl+6×Loading Buffer 1 μl，加入2%琼脂糖电泳板中，在0.5×TAE缓冲液中，100伏的恒压下电泳1h。溴乙啶染色30min，在紫外光(310 nm)下鉴定是否有目标产物条带。

　　1.2.4 DNA序列测定 用ExTaq酶按照上述同样的PCR扩增条件和体系，扩增HNF1alpha全基因启动子和10个外显子。采用50～100 μl PCR产物进行纯化，纯化后的PCR产物仍然用2%琼脂糖电泳、显影鉴定。如果显示为单一、清晰、明亮目标条带，则直接送天津宝生物公司用ABI Prism377型自动测序仪进行DNA测序。

　　1.2.5 标准突变峰型的筛查 根据家系先证者DNA测序结果，对发现杂合突变的个体，用变性高效液相色谱法(denaturing highperformance liquid chromatograph，DHPLC)筛查出标准突变峰型，并以此为标准条件，同样用DHPLC方法对家系中其他成员、无血缘关系散发的迟发起病2型糖尿病患者群体和正常人群进行HNF1alpha相关位点基因扫描。

　　1.3 统计学方法 采用Windows SPSS 11.5分析软件。各组间临床生化指标采用方差分析;家族性早发2型糖尿病/MODY家系组各基因型频率比较采用家系内关联分析。

　　2 结果

　　2.1 PCR扩增HNF1alpha各外显子目标条带在琼脂糖电泳后紫外光下显影结果见图1。

　　2.2 在7个早发2型糖尿病/MODY家系先证者中发现的突变

　　1)编码区域突变。见表2。表2 在7个早发2型糖尿病/MODY家系先证者中发现的HNF1alpha基因编码区突变 2)非编码区域突变。见表3。表3 在7个早发2型糖尿病/MODY家系先证者中发现的HNF1alpha基因非编码区突变

　　2.3 各编码区的突变位点测序图 见封三图2。

　　2.4 标准突变峰型的筛查结果

　　1)HNF1alpha外显子1 野生型图形。见图3。

　　2)包含HNF1alpha外显子1 I27L杂合错义突变的图形。见图4(A～D)。图A、B、C、D虽然峰型有所差别，但其代表的样品DNA直接测序均可见I27L杂合错义突变。峰型出现差异的原因是不同样品除了有I27L杂合错义突变外，还各自在内含子部分存在其他不同的杂合变异。因此可以将其均作为标准峰型，推断是否存在I27L杂合错义突变。

　　图3 HNF1alpha外显子1 野生型图形

　　图4 包含HNF1alpha外显子1 I27L杂合错义突变的图形

　　2.5 HNF1alpha基因的I27L错义突变在家系中各成员的分布 见图5。

　　图5 HNF1alpha基因的I27L错义突变

　　在家系中各成员的分布

　　图中数字和字母的含义：①符号右上角的数值——代表先证者起病的年龄;②符号下角的字母AA——代表I27L位点基因型为AA;③符号下角的字母AC——代表I27L位点基因型为AC;④符号下角的字母CC——代表I27L位点基因型为CC。箭头所指为先证者。

　　2.6 I27L变异与糖尿病有相关性 仅在家系A发现I27L变异与糖尿病有相关性，成员临床资料见表4。

　　2.7 I27L不同基因型成员的临床资料比较 见表5。

　　2.8 基因型与临床表现的相关性 由上述结果可以看出，尽管AA基因型和AC基因型个体的各项临床指标无明显差异，但CC基因型组的年龄、WHR、HbA1c、FPG、TG、TC 、HOMAIR均明显高于AA基因型组和AC基因型组(P<0.05)，而HOMAIS则低于AA基因型组和AC基因型组，提示CC基因型组个体有着比AA基因型组和AC基因型组更为严重的糖、脂代谢紊乱，且具有更高的胰岛素抵抗和更低的细胞功能。对家系中PT2DM、PIGR和PNGT 3个亚组进行基因型和临床表现间关系的分析显示，CC基因型群体比AC基因型和AA基因型群体有更明显的胰岛素抵抗(HOMAIR分别为CC：24.66±20.59 VS AA：4.17±3.42 VS AC：6.23±3.66，P<0.05)，细胞功能在三者间无明显差异。而AC基因型和AA基因型群体间临床表型上亦无明显差异。AC基因型个体120 min胰岛素水平比AA基因型个体明显低(AA：77.12±47.34 mU/L VS AC：40.95±21.03 mU/L，P<0.05)。家族性早发2型糖尿病/MODY家系组内P T2DM、PIGR和PNGT3个亚组的I27L位点基因型(AA、CC、AC)频率进行关联分析，结果显示3组间基因型频率差异无统计学意义(0.25

　　3 讨论

　　MODY3基因——HNF1alpha是一种组织特异性且包含同源结构的转录因子，属于HNF1的类固醇激素超家族。其不仅可以通过胰岛素启动子调控胰岛素表达[4]，而且也是葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)和左旋丙酮酸激酶(PK)的转录激活因子。故HNF1alpha基因突变可使胰岛素分泌受损。此外，肝脏糖酵解基因的转录活化要依赖于葡萄糖和胰岛素的作用，所以HNF1alpha有可能也直接影响肝脏葡萄糖的代谢。HNF1alpha中所有功能域的突变都可导致MODY3的发生，这类突变有可能是通过单倍型缺陷或显性失活机制造成有功能转录因子数量的改变而致病。由于HNF1alpha表4 家系A的临床资料表5 I27L不同基因型成员的临床资料比较的纯合二聚体形成有活性的转录因子，突变缺损的HNF1alpha[5]可以和野生型的HNF1alpha蛋白结合成无功能的二聚体，如果突变的HNF1alpha基因表达，照此计算，HNF1alpha二聚体的转录功能可能削减2/3[6]。

　　我们对有7个早发糖尿病患者的家系的研究显示：其先证者发病年龄早，平均为(26.14±4.30);胰岛β细胞的功能有所减退，特别是餐后2 h的胰岛素分泌量明显减少;无明显高血压、高脂血症等其他代谢紊乱的表现;遗传倾向明显，家族聚集性强，三代都有患者。从临床表现上分析总体符合MODY标准。对他们进行HNF1alpha全基因外显子的DNA直接测序发现，大于50%的个体出现Leu17Leu、I27L、Leu459Leu、Gln486Gln、S487N、S574G等6种编码区基因变异。用DHPLC方法对家系内各成员的I27L (ATC→CTC)位点进行扫描，其等位基因A的频率为0.70，等位基因C的频率为0.30。Pruhova等[7]报道该位点在捷克斯洛伐克MODY家系人群中等位基因A的频率为0.64，等位基因C的频率为0.36;Maggie等[8]报道该位点在中国香港地区早发2型糖尿病(初次诊断糖尿病年龄小于40岁)人群中等位基因A的频率为0.57，等位基因C的频率为0.43[8]。因此需要进一步对大规模人群进行该位点的基因扫描，从而证明该位点是否和家族性早发2型糖尿病相关。

　　我们的研究仅在家系A发现I27L变异与2型糖尿病发病有明显的关系，即该家系的2型糖尿病患者均为I27L位点的AC基因型或CC基因型，但由于该家系成员较少，无法证明家系中无I27L位点变异的个体一定为NGT。对Earlyonset DP组中各成员按I27L基因型不同，分为AA型、CC型、AC型3个亚组，其临床特征比较显示：CC型个体有着比AA、AC型更为严重的糖、脂代谢紊乱(P<0.05)，并且CC型个体均为2型糖尿病患者。而AA型和AC型两种基因型在家系中2型糖尿病患者、IGR个体和NGT个体均可见到，对家系内PT2DM亚组、PIGR亚组和PNGT亚组作AA、AC、CC基因型的家系内关联分析，未见明显的差异(0.25

　　多态信息含量(PIC)是度量群体杂和度的方法，Gill等将PIC≥0.7的座位作为高鉴别能力的遗传标志物[9]。而本研究显示HNF1alpha基因I27L位点的PIC值(分别为0.55和0.20)均小于0.7，尚不能作为家族性早发2型糖尿病的遗传标志物。

　　本研究还在E家系发现E73K、E105G两种杂合错义突变;B家系发现G184W杂合错义突变，由于研究仅局限于家系先证者，故目前无法肯定判断其是否为存在共分离现象的致病突变，因此这些突变是否具有临床意义，或者仅仅是基因多态性还需要进一步研究。

　　在白种人位于外显子4的P291fsinsC突变占HNF1alpha基因突变的20%～25%，这个突变热点在3个德国糖尿病家系[3]，7个英国糖尿病家系[10]和4个芬兰糖尿病家系[11]中得以证实。但在本研究的7个早发2型糖尿病家系的先证者中，HNF1alpha基因的外显子4均未发现任何突变，而是在其外显子1、7发现多个SNP。可见，P291fsinsC虽然是突变热点，但仍然存在种族异质性。

　　除了在HNF1alpha编码区发现变异外，我们还在非编码区发现IVS1+1G→T、IVS142A→G、IVS251A→T、IVS223C→T、IVS7+7G→A、IVS7+2T→A、IVS924T→C(部分位点变异的等位基因频率已分别由Kazuya[12]和Maggie[8]相继报道)等变异。尽管大多数基因编码区和拼接区突变都会使该基因功能产生异常，但基因产物功能的异常并不仅仅局限于基因编码区和拼接区突变所致，其他部位的突变或变异也可能会影响基因表达。越来越多的研究显示，一些内含子位点的SNP也会对基因的结构和功能产生影响。因此，可以对早发2型糖尿病家系中有上述SNP位点和没有上述SNP位点的青少年做追踪随访观察，对他们是否以后患糖尿病的情况进行统计，从而判断这些SNP在遗传缺陷与HNF1alpha基因表达调控方面是否存在相关性。

　　【参考文献】

　　1 Massa O, Meschi F, CuestaMunoz A, et al. High prevalence of glucokinase mutations in Italian children with MODY:Influence on glucose tolerance, firstphase insulin response, insulin sensitivity and BMI[J]. Diabetologia, 2001，44:898905.

　　2 Ellard S. Hepatocyte nuclear factor 1 alpha (HNF1 alpha) mutation in maturi

　　tyonset diabetes of the young[J].Hum Mutat,2000,16(5):377385.

　　3 Kaisaki P J, Menzel R, Linder T, et al. Mutations in the hepatocyte nuclear factor1β gene in MODY and earlyonset NIDDM: evidence for a mutational hotspot in exon4[J].Diabetes,1997,46:528535.

　　4 Okita K, Yang Q, Yamagata K, et al. Human insulin gene is a target gene of hepatocyte nuclear factor1 alpha(HNF1alpha) and HNF1beta[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1999,263:566569.

　　5 Hattersley A T. Maturityonset diabetes of the young:Clinical heterogeneity explained by genetic heterogeneity[J].Diabetes Med, 1998,15:1524.

　　6 Lazzaro D, De Simone V, De Magistris, et al. LFB1 and LFB3 homeoproteins are sequentially expressed during kidney development[J]. Development, 1999,114:469479.

　　7 Pruhova S,Lebl J.Genetic epidemiology of MODY in the Czech republic: new mutations in the MODY genes HNF41, GCK, and HNF1[J].Diabetologia, 2003,46:291295.

　　8 Cockburnt M C Y，Lindnert T H.Molecualr genetics of diabetes mellitus in Chinese subjects: indetification of mutations in glucokinase and hepatocyte nuclear factor1 genes in patients with earlyonset Type 2 diabetes mellitus/MODY[J].Diabetic Medicine，1999,16:956963.

　　9 Gill P.A new method of STR interpretation using inferential logicdevelopment of a Criminalintelligence database[J].Int J Leg Med，1996,109:14.

　　10Fraying T M, Bulman M P, Ellard S, et al. Mutations in the hepatocyte nuclear factor1 gene are a common cause of maturityonset diabetes of the young in the U.K[J].Diabetes,1997,46:720725.

　　11Glucksmann M A, Lehto M, Tayber O, et al. Novel mutations and a mutational hotspot in the MODY3 gene[J].Diabetes,1997,46:10811086.

　　12Kazuya Y, Naohisa O, Pamela J K, et al. Mutations in the hepatocyte nuclear factor1β gene in maturityonset diabetes of the young(MODY3) [J]. Nature,1996,384:455458.