胺碘酮对兔急性心肌梗死左室心外膜细胞瞬间外向钾电流影响的研究

　　【摘要】 目的 探讨胺碘酮对急性心肌梗死(AMI)后心外膜梗死边缘区及非梗死区心肌细胞瞬间外向钾电流(Ito)的影响。方法 30只兔随机分为3组：正常对照组(CON组)，建立AMI动物模型后分为梗死边缘区组(AMIR组)及非梗死区组(AMIN组)。1周后用膜片钳技术研究左心室梗死边缘区及非梗死区心外膜心肌细胞(Epi)Ito密度的改变，并记录胺碘酮对Ito密度的影响。结果 CON组左室Epi细胞Ito在+70 mV时的电流密度明显大于AMIR组及AMIN组( P<0.01);AMIR组与AMIN组Epi细胞的Ito密度有明显差异(P<0.05);胺碘酮灌流后AMIR组与AMIN组Ito密度显著降低，Ito失活及灭活后再恢复均变得缓慢。结论 AMI后梗死边缘区、非梗死区Epi细胞Ito密度存在差异性;胺碘酮可降低心肌梗区Ito密度。

　　【关键词】 胺碘酮,心肌梗死,瞬间外向钾电流,兔

　　The effect of amiodarone on the transient outward potassium current of left ventricular epicardium myocytes in rabbit myocardial infarction model ZHANG Tiejun,LI Diangui,ZHANG Caiping,et al.Department of Cardiology,the Traditional Chinese Medical Hospital,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China

　　【Abstract】 Objective To explore the effects of amiodarone on the transient outward current (Ito) of myocardium in infarcted zone and non infarcted zone in rabbit acute myocardial infarction model.Methods Thirty rabbits were randomly separated into 3 groups, control group (CON),AMI model group with remote from infarcted myocardium (AMIR),and AMI model group with non infarcted myocardium (AMIN).After 1 week later AMI model set up,the Ito density were detected in remote zone from infarcted myocardium and non infracted myocardium,with patch clamp technology.The effect of amiodarone was recorded and analyzed.Results In CON group,the peak Ito density of epicardium (Epi) cells was higher than AMIR group and AMIN group(P<0.01);the peak Ito density of AMIN group was higher than AMIR group(P<0.05);the amiodarone decrease the peak Ito density.Conclusion It demonstrated that the Ito density had variety between infarcted zone and non infarcted zone in rabbit AMI model,furthermore,the amiodarone could decrease the density of Ito.

　　【Key words】 Amiodarone;Myocardial infarction;Transient outward potassium current;Rabbit

　　急性心肌梗死可并发多种心律失常进而引起心源性猝死，其中室性心律失常是主要因素之一。心室跨壁电生理异质性[1]是近年重点研究方向。胺碘酮(amiodarone)作为III类抗心律失常药物，已在多项临床试验中被证明有良好的抗心律失常作用，进而成为治疗心律失常的主要药物之一。然而目前关于其对心室肌梗死后不同部位心肌细胞瞬间外向钾电流(Ito)异质性的研究尚罕见报道。本文拟通过膜片钳全细胞记录方法对兔心肌梗死后左室梗死边缘区和非梗死区单个心外膜(epicardium，Epi)心室肌细胞进行研究，探讨Epi心肌Ito电生理特性变化以及胺碘酮对Ito的影响，进而为合理应用胺碘酮治疗室性心律失常提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 实验动物：新西兰纯种大耳白兔30只,由河北医科大学实验动物中心提供，雌雄不拘，体质量1.5～2.0 kg，随机分为3组，正常对照组(CON组)、心肌梗死边缘区组(AMIR组)和心肌梗死非梗死区组(AMIN组)，每组10 只。CON组不结扎冠状动脉;后2组采用结扎冠状动脉左前降支的方法[2]建立心肌梗死动物模型后分为AMIR组和AMIN组,单笼饲养1周后备用。实验药物：胺碘酮为美国Sigma公司产品，将胺碘酮灌流液用50%乙醇溶解，配制成10×10-3mol/L母液，冷藏保存，实验时在含有0.04%牛血清白蛋白灌流液中加入胺碘酮，使之达灌流所需浓度：4.4×10-5mol/L[2]。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 单个心室肌细胞分离: 梗死模型建立后1周猝击兔头颅枕部致昏，迅速开胸切取心脏，置于4°C的无钙台氏液中，连接在Langendorff心脏灌流装置上，经主动脉根部逆行用无钙台氏液灌流10 min，用含I 型胶原酶0.4 g/L、牛血清蛋白0.2%的无钙台氏液反复灌流8～10 min，剪下距离梗死区边缘2 mm的游离左心室肌和距梗死区边缘4 mm游离心室壁，前者为梗死边缘区，后者为非梗死区[3]，去掉心内膜面乳头肌。以眼科剪、眼科钳准确将心室壁横剖，紧邻心外膜侧1.0～1.5 mm取外膜层细胞,将之分别剪碎，置于稀释1倍的酶液中搅拌，整个过程保持恒温36℃同时充入氧气，至4～5 min后可于镜下看到大量存活的心肌细胞，最后过滤离心保存在KB液中保存，1 h后细胞膜恢复状态后使用。

　　1.2.2 细胞封接与全细胞记录模式的建立： 按文献[4]建立全细胞膜片钳记录模式后，分别记录CON组、AMIR组和AMIN组Epi细胞Ito电流，并在记录Ito后加入胺碘酮溶液，再次记录Ito为消除细胞间误差,电流值以电流密度(pA /pF)表示。

　　1.2.3 Ito的记录方法： 电流—电压曲线(IV曲线)：先将细胞钳制在-50 mV,超极化至-160 mV，使通道充分开放，持续50 ms，去极化至-40 mV，使钠通道失活，50 ms后去极化脉冲从-30 mV到+70 mV，阶跃10 mV，时程250 ms。以不同钳制电压下的Ito强度绘成IV曲线。分别记录各组的IV曲线及钳制电压为+70 mV时的电流，并与对照组比较。

　　失活曲线的电压诱导方案：先将细胞钳制在-50 mV,超极化至-100 mV，持续250 ms，阶跃10 mV，至-40 mV，去极化至+70 mV，持续250 ms，阶跃10 mV。将记录的Ito与最大激活时的Ito之比，与相应的条件脉冲膜电位作图得Ito通道失活曲线。分别记录各组失活曲线。

　　恢复曲线的电压诱导方案：先将细胞钳制在-50 mV,然后去极化至+60 mV，持续250 ms，在第1个脉冲回到HP后不同时间间隔给予第2个脉冲去极化到60 mV,持续时间250 ms，第2个脉冲从30 ms记起，以后重复上述程序，每次阶跃15 ms,逐级递增至240 ms。以第2个脉冲与第1个脉冲的Ito之比与相应的时间间隔作图，得Ito通道灭活后恢复过程曲线。分别测量30、90、165及240 ms时的恢复电流的大小并与最大值作比较，分别记录各组的失活后恢复曲线，并与对照组作比较。

　　1.3 统计学方法 用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 Epi细胞Ito IV曲线的变化 Epi细胞Ito密度于+70 mV时均达最大值，AMIR组及AMIN组Epi细胞的IV曲线较CON组Epi细胞下降，电流密度CON组为(111±16 )pA/pF(11个细胞)明显大于AMIR组的(53±10)pA/pF(12个细胞)及AMIN组的(72±9)pA/pF (15个细胞)，差异有统计学意义(P<0.01)，AMIR组及AMIN组电流密度之间比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

　　胺碘酮灌流后AMIR组及AMIN组在+70 mV的Ito密度明显下降，分别为(25±10) pA/pF (12个细胞)和 (32±8) pA/pF (13个细胞),差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

　　2.2 Ito失活曲线的比较 CON组、AMIR组及AMIN组半数失活电压(V0.5)分别为(-68±8)mV (12个细胞) 、(-60±7)mV (11个细胞)和(-56±9)mV (13个细胞)，CON组在-30 mV完全失活，AMIR及AMIN组Epi细胞的失活曲线与CON组比较形态无明显变化，均在-20 mV完全失活， CON组与AMIN组比较差异有统计学意义(P<0.05)，AMIR及AMIN组差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

　　AMI组灌流胺碘酮后AMIR组与AMIN组失活曲线均在-30 mV完全失活，两者细胞V0.5分别为(-54±9)mV (12个细胞)和(-50±9)mV (11个细胞)，差异无统计学意义(P>0.05)。

　　2.3 Ito灭活后再恢复曲线 AMIR组较CON组灭活后再恢复减慢,差异有统计学意义(P<0.05);经灌流胺碘酮后AMIR组及AMIN组较CON组灭活后再恢复减慢，差异有统计学意义(P<0.05)，AMIR组及AMIN组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1、图5。表1 3组灭活后再恢复在不同时点的百分比

　　3 讨 论

　　各种心律失常的发生与细胞膜离子通道电流的异常改变密切相关。心肌动作电位是细胞膜上多种离子通道顺序开关综合作用的结果[5]，其中Ito 是心肌细胞复极化电流的重要成分之一， Ito所介导的2相折返很可能是在心肌缺血及再灌注心律失常的发生机制[6]。Ito有2种成分：(1)可被4氨基吡啶(4AP)阻断的Ito1;(2)钙离子依赖性的Ito2[7]。本研究中电极内外液含阻断Ca2+的成分，所以本文记录的Ito实际为Ito1。

　　动物实验证实心肌梗死后梗死中心区、边缘区以及非梗死区发生组织重构，同时心肌细胞也发生了电重构，推测与Ito降低相关的动作电位时程延长相关[8]。文献报道[9]心肌梗死3 d后，大鼠左室非梗死区Ito明显下降，与本结果显示：兔心肌梗死后1周左室梗死边缘区及非梗死区心外膜细胞Ito密度下降一致，其中以AMIR组Epi下降最明显，与Lukas等[6]报道的外膜层细胞对缺血敏感是一致的。梗死边缘区及非梗死区Epi细胞Ito的失活曲线右移，失活变的缓慢;梗死边缘区Epi的灭活后再恢复缓慢，以上结果表明：心肌梗死后梗死边缘区、非梗死区Epi细胞中的Ito电生理特性的不均一性,可以导致梗死边缘区和非梗死区Epi心肌细胞2相平台期之间显著的电压梯度差异,增加发生2相折返的机会,从而诱发心律失常;心肌梗死后心脏不同部位的复极差异明显，可能是引起折返性室性心律失常的离子基础。

　　本研究证实在胺碘酮作用下梗死边缘区、非梗死区细胞Ito密度减低、失活曲线右移并趋向一致，与文献研究显示胺碘酮延长心室的动作电位时程一致[10]。本研究显示胺碘酮通过抑制梗死边缘区及非梗死区细胞复极电流Ito密度，同时减轻左右室之间及左室不同部位心室肌细胞Ito[11]之间的电生理异质性，降低心肌梗死后复极的离散度，消除由于细胞间复极不一致性而产生的折返，从而降低心律失常的发生。

　　【参考文献】

　　1 Sicouri S,Antzelevitch C.A subpopulation of cells with unique electrophysiological in the deep epicardium of the canine ventricle: The M cells[J].Circ Res,1991，68(6):1 7291 741.

　　2 齐书英，刘坤申，何振山，等.兔冠状动脉结扎1 h缺血区心室肌细胞瞬间外向钾电流通道的变化[J].中国心脏起搏与心电生理杂志,2003，17(4)：287291.

　　3 张铁军,何振山,齐书英，等.兔心肌梗死1周后梗死边缘区心室肌瞬间外向钾电流通道的变化[J].基础医学与临床,2006，26(2)：209210.

　　4 丁超，何振山，陈会校，等.辛伐他汀对血脂正常兔心肌缺血再灌注后L型钙电流的影响[J].中国心脏起搏与心电生理杂志，2008,22(4):357360.

　　5 Antzelevitch C,Dumaine R.Electrical heterogeneity in the heart :physiological,pharmacological and clinical implications//Page E.Fozzard HA,eds.Hand book of physiology:The Cardiorvascular System[M].NewYork:Oxford University Press,2002:654692.

　　6 Lukas A,Antzelevitch C.Differences in the electrophysiological response of canine ventricular epicardium and endocardium to ischemia.Role of the transient outward current[J].Circulation,1993,88(6):2 9032 915.

　　7 Escande D,Coulomber A,Faivre JF,et al.Two type of transient outaord current in adult human atrial cells[J].Am J physical,1987,252:H142H148.

　　8 Perrier E,Kerfant BG,Lalevee N,et al.Mineralocorticoid receptor antagonism prevents the electrical remodeling that precedes cellular hypertrophy after myocardial infarction[J].Circulation,2004,110 (7) : 776783.

　　9 Jeck C,Pinto J,Boyden P,et al.Transient outward currents in subendocardial Purkinje myocytes surviving in the infarcted heart[J].Ciculation,1995,92(3):465473.

　　10 Varro A,Virag L,Papp JG.Comparison of the chronic and acute effects of amiodarone on the calcium and potassium currents in rabbit isolated cardiac myocytes[J]. Br J Pharmacol,1996,117(6): 1 1811 186.

　　11 Aimond F,Alvarez JL,Rauzier JM,et al.Ionic basis of ventricular arrhymias in remodled rat during long term myocardial infarction[J].Cardiovasc Res,1999,42(2):402415.