柚皮素诱导的K562细胞凋亡机制中PI3K和Akt的表达

　　【摘要】 目的 研究柚皮素(naringenin)对人慢性髓　系白血病K562细胞株凋亡作用与PI3K/Akt路径的关系。方法 MTT法检测柚皮素在不同浓度、不同培养时间对K562细胞凋亡的影响;用免疫组织化学的方法检测柚皮素作用下K562细胞中的PI3K和Akt的表达。结果 柚皮素对K562细胞凋亡有明显诱导作用;PI3K和Akt的表达与柚皮素作用浓度和时间呈负相关关系。结论 柚皮素对K562细胞具有明显的诱导凋亡作用，其作用机制可能是通过减少K562细胞表达PI3K和Akt来实现。

　　【关键词】 柚皮素,凋亡,PI3K,Akt

　　Relation of Apoptosis of K562 Cells Induced by Naringenin to Expression of PI3K and Akt

　　Hu Ning, Zuo Xuelan, Liu Minghui

　　Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071

　　【Abstract】Objective To investigate the apoptotic effect of naringenin on K562 cells and the role of PI3K and Akt pathway.Methods The apoptotic effect of naringenin in K562 cell line was detected by MTT method, and the expression of PI3K and Akt in K562 cell line affected by naringenin was examined by immunohistochemical stain.Results The apoptotic effect of naringenin on K562 cell line was obviously observed. The expression of PI3K and Akt of K562 cell line gradually reduced with the increasing concentration of naringenin.Conclusion Naringenin has a significant apoptotic effect on K562 cell line, which may be conducted by the down-regulation of PI3K and Akt.

　　【Key words】naringenin; apoptosis; PI3K; Akt

　　柚皮素(naringenin，NGEN)是一种从柑橘类水、普洱茶籽、长白瑞香等植物中提取的天然苦味化合物，它是柚苷的甙元。近年来，国外医药工作者对柚皮素的研究日益增多，发现其具有多种药理活性，主要有抗氧化、抗衰老[1]、抗肿瘤[2]、抗动脉粥样硬化、DNA修复作用等[3]。我们的前期研究结果发现，柚皮素亦可抑制K562细胞增殖，诱导其凋亡[4]，但机制尚不清楚。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)是一个包括许多脂质激酶的家族，可以激活Akt及下游众多靶分子，调节细胞的生存、增殖和代谢，从而使PI3K/Akt通路产生抗凋亡、促增殖的活性。本研究检测柚皮素诱导的K562细胞内是否表达PI3K和Akt，以期深入探讨柚皮素诱导K562细胞凋亡的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 药物 柚皮素(Sigma公司产品);二甲基亚砜(DMSO)(Amersco公司产品)，将其溶解为400 mmol/L(储备液)，-20 ℃保存备用;RPMI-1640及新生小牛血清(Hyclone公司产品);四甲基偶氮唑兰(igma公司产品);PI3K、Akt抗体、HRP标记羊抗兔二抗(博士德公司产品);S-P免疫组化试剂盒(迈新公司产品)。

　　1.2 细胞培养 K562细胞株购自武汉大学中国典型生物保藏中心。用含10%小牛血清的RPMI1 640培养基于37 ℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，每2～3 d换液传代1次。实验用细胞为对数生长期细胞，经台盼兰染色检查细胞活性在98%以上。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 细胞增殖的测定 采用四甲基偶氮唑兰微量酶标比色法[3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]测定。将K562细胞密度调整为1.5×105/ml后接种于96孔培养板，每孔100 μl，设5个复孔。实验组柚皮素的终浓度为0 μmol/L，100 μmol/L，200 μmol/L，400 μmol/L和800 μmol/L。分别孵育12 h、24 h、48 h，实验结束前4 h加入5 mg/ml的MTT 10 μl，37 ℃孵育4 h后吸去上清液，加入100 μl DMSO，震荡溶解结晶后置酶标仪(美国Stat公司产品)测吸光度值(A)，波长为570 nm。细胞增殖抑制率(%)=(对照组A值-加药组A值)/对照组A值×100%。

　　1.3.2 柚皮素处理后PI3K、Akt的表达检测 采用SP免疫组化测法定。将K562细胞密度调整为1.5×105/ml后接种于24孔培养板，每孔1 ml，设置5个复孔。实验组柚皮素终浓度为0 μmol/L，100 μmol/L，200 μmol/L，400 μmol/L和800 μmol/L。孵育48 h后检测通过免疫组化SP法检测PI3K和Akt的表达情况。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，并对结果进行光密度分析。高倍镜下随机选取10个视野，用Image pro plus软件(Media Cybernetics公司产品)计算每个视野的累计光密度(IOD SUM)，然后除以每个视野的细胞个数，得出平均累计光密度。

　　1.4 图像分析及统计学分析 应用Image pro plus对图像进行光密度分析，SPSS11.0软件包处理数据。采用方差分析和t检验，P<0.05为有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 K562细胞凋亡率 柚皮素对K562细胞生长有明显的抑制作用，且与柚皮素作用时间呈正相关，与其浓度呈剂量依赖性。相同浓度下，随着细胞培养时间延长，柚皮素对K562细胞生长的抑制加强(P<0.05);随着浓度的增加，柚皮素对K562细胞生长的抑制加强(P<0.05)。见表 1。

　　2.2 K562细胞PI3K和Akt 的表达。经柚皮素处理后，K562细胞的 PI3K和Akt 的表达降低，见封四图 1。胞浆内含棕黄色颗粒者为阳性细胞。

　　用Image pro plus软件对免疫组化结果进行光密度分析，结果显示在相同培养时间下，K562细胞的PI3K和Akt的表达随着柚皮素浓度的增加逐渐降低(P<0.05)。见表 2。　表1 不同浓度NG作用K562细胞12、24和48 h的凋亡率表2 作用48 h后不同柚皮素浓度下K562细胞PI3K、Akt表达情况

　　3 讨论

　　肿瘤的发生发展与细胞凋亡有密切的关系，研究证明多种化疗药物是通过对肿瘤细胞的凋亡机制调控发挥作用的。黄酮类化合物的抗肿瘤作用已明确，其作用机制可能为：细胞周期阻滞、诱导凋亡[5]，抑制血管发生，抗氧化，逆转耐药，调整体内性激素水平，促进DNA修复，抑制亚细胞的信号传导，防止癌变[6]，或上述机制的联合等[7]。柚皮素作为黄酮类化合物的一种，其抗肿瘤作用也逐渐被人们证实。已有研究结果证实，柚皮素对胃癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠癌、白血病均有细胞毒作用[8]。本研究结果及前期研究结果[4]证明，柚皮素能有效诱导K562细胞的凋亡，并且这种诱导凋亡作用成时间和浓度依赖性。

　　PI3K是一个包括许多脂质激酶的家族。目前对PI3K的研究中以对I类激酶了解最为透彻，而且其与造血系统密切相关。I类PI3K由一个调节亚基(p85)和一个催化亚基(p110)组成，当对应的受体被配体激活后，结合并激活p85，随之p110活化，催化膜表面的磷酸肌醇二磷酸(PIP2)生成磷酸肌醇三磷酸(PIP3)。PIP3作为第二信使，使Akt被完全激活，Akt激酶下游也有众多靶分子：包括促凋亡蛋白Bad、Caspase9、转录因子NF-κB和Foxo、细胞周期依赖性激酶抑制分子p21等，作用于多种底物来调节细胞的生存、增殖和代谢。Akt作为PI3K的一个重要的下游靶分子，可以通过直接或间接的机制发挥抗凋亡作用。一些研究证实，PI3K/Akt信号途径的因素在人类肿瘤中常常改变，过度表达的Akt可诱导恶性转化和化学抵抗。此外有研究表明[9]，PI3K/Akt信号途径与不同的信号途径的抑制，可以有效的使肿瘤细胞线粒体破坏和凋亡。Hee等[10]证实，柚皮素诱导的凋亡伴随着线粒体膜电位的超极化下调BCL-2，上调BAX，激活caspases-3， 随后ADP核糖聚合酶分解。caspases的激活以及线粒体机能失调伴随PI3K/Akt信号转导途径的失活从而诱导人类白血病THP-1细胞凋亡。因此PI3K/Akt途径的出现是分子治疗的新目标。本实验通过免疫细胞化学技术检测NGEN作用前后K562细胞PI3K、Akt表达情况，结果发现处理组细胞中随着NGEN浓度的增加PI3K、Akt均表达下降。提示NGEN诱导K562细胞凋亡的机制可能与PI3K/Akt途径有关。

　　【参考文献】

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　　3 Gao K，Henning S M ，Niu Y，et al.The citrus flavonoid naringenin stimulates DNA repair in prostate can cer cells[J].Nutr Biochem，2006，17(2):8995.

　　4 左学兰，周颖，李瑞芳，等.柚皮素诱导K562细胞凋亡与Caspase-3/Caspase-8酶活性及FAS/FASL蛋白表达的关系[J].中国实验血液学杂志，2008，16(2):286289.

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　　10Park J H，Cheng Y J.Naringenin induces apoptosis through downregulation of AKt andcaspase-3 activation in human leukemiaTHP-1 cells[J].Food and Chemical Toxicology，2008，46(12):36843690.