体外循环对小儿VSD患者外周血T细胞亚群和单个核细胞AgNORs的影响

　　【摘要】 目的 系统探讨小儿室间隔缺损(ventricular septal defect，VSD)患者体外循环(extracorporeal circulation,ECC)前后T细胞亚群的比例和单个核细胞核仁组成区(nucleoar organizer regions，NORs)嗜银蛋白(AgNORs)的变化规律。方法 应用免疫组织化学和组织化学染色测定32例行VSD修补术的患儿静脉血标本5个时间点的T细胞亚群细胞百分率和单个核细胞AgNORs的数量。结果 与麻醉诱导后比较，成熟T淋巴细胞(CD+3细胞)及Th细胞(辅助性/诱导性T淋巴细胞，CD+4细胞)在停ECC即刻时降低(P<0.05)，术后第1、3天均显著降低(P<0.01)，术后第1天降到最低值[(46±6)%与(21.5±4.0)%]，术后第3天时回升，术后第7天时恢复至麻醉诱导后水平(P>0.05);Th/ Tc(抑制性/细胞毒性T淋巴细胞，CD+8细胞)比值在术后第1天时显著降低至(1.34±0.38)(P<0.01)，术后第3天即恢复到麻醉诱导后水平(P>0.05);Tc细胞和单个核细胞AgNORs无显著变化(P>0.05)。结论 T淋巴细胞总数、Th细胞的比例变化和Th/ Tc比值变化有可能作为评价ECC后小儿VSD患者细胞免疫功能受抑制的重要指标;在单个核细胞AgNORs功能不受影响的前提下，于ECC前后应积极采取有效措施改善患儿T淋巴细胞免疫功能状态，增加抗感染能力，减少VSD小儿围ECC期并发症的发生。

　　【关键词】 体外循环,室间隔缺损,T细胞,AgNORs

　　【Abstract】 Objective To investigate the changes of T lymphocyte cell subsets and AgNORs of mononuclear immune cells before and after extracorporeal circulation (ECC) in infants with ventricular septal defect (VSD) who underwent ventricular septal defect repair.Methods The percentage of T lymphocyte cell subsets and the number of AgNORs of mononuclear immune cells at 5 different time points in the peripheral venous blood samples of 32 infants with VSD who underwent ventricular septal defect repair with ECC were detected by immunohistochemistry and histochemistry staining.Results As compared with those after anesthesia,the CD+3 cells and Th cells(CD+4 cells) were significantly decreased immediately at ECC (P<0.05),which were obviously decreased at the 1st day and the 3rd day after the operation(P<0.01),which were the lowest at the 1st day after the operation[(46±6)% and (21±4)%],however,which began to increase at the 3rd day after operation, which recovered to the levels after anesthesia induction at the 7th day after operation (P>0.05).The ratio of Th/ Tc was significantly decreased by 1.34±0.38 at the first day after the operation (P<0.01)，however，which recovered to the levels after anesthesia induction at the 3rd day after operation (P>0.05).But there were no significant changes for T lymphocyte cell subsets and AgNORs of mononuclear immune cells (P>0.05).Conclusion The changes of T lymphocyte cell number,Th cells proportion and the ration of Th/ Tc may be used as the important indexes for evaluating the inhibitory state of cellular immunity function in infants with VCD after ECC.Under the precondition of the function of AgNORs of mononuclear immune cells being not affected,the effective measures should be taken to improve patients’ cellular immunity function,enhance patients’ antiinfection ability and decrease the occurrence of complications during ECC.

　　【Key words】 extracorporeal circulation; ventricular septal defect;T lymphocyte;AgNORs

　　体外循环(Extracorporeal circulation，ECC)心内直视手术患者术后易出现各种感染性并发症，甚至发展成多器官功能衰竭(MSOF)，是心内直视手术患者术后死亡的主要原因之一[1]。本研究希望能通过检测小儿室间隔缺损(ventricular septal defect,VSD)患者ECC前后T细胞和单个核细胞核仁组成区嗜银蛋白(AgNORs)的动态变化规律，为临床防治ECC后细胞免疫抑制提供临床监测指标。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　随机选择2005年10月至2007年3月河北省儿童医院择期于ECC下行室间隔缺损修补术的患儿32例，其中男19例，女13例;年龄8个月～3岁，平均年龄(1.6±0.3)岁;体重7.1～13 kg，平均(11.3±1.2)kg。ASA分级Ⅱ或Ⅲ级，以上病例均无其它系统性疾病，术前无感染及免疫功能异常，无激素或免疫调节剂的用药史。

　　1.2 仪器与试剂

　　全自动数码显微镜购自中国MOTIC公司，T细胞亚群染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。

　　1.3 麻醉与ECC方法

　　患者入室前给予氯胺酮6 mg/kg，肌内注射，麻醉诱导应用芬太尼10 μg/kg，咪唑安定0.1 mg/kg，维库溴铵0.1 mg/kg，行气管插管。气管插管后复合异氟烷吸入维持麻醉，术中间断追加咪唑安定、芬太尼、维库嗅铵以及吸入异氟烷维持麻醉。麻醉后行左桡动脉穿刺置管，常规行右颈内静脉穿刺置管测中心静脉压(CVP)。手术全程连续监测心电图、血氧饱和度、桡动脉血压、CVP、呼气末CO2分压、鼻咽温、肛温、尿量，定时查动脉血气、红细胞压积及电解质。

　　体外循环应用膜式氧合器(Medtronic，美国)，Sarns 8000型滚压泵、科威儿童型体外循环管道和科威儿童型动脉微栓过滤器。采用全身浅低温和中度血液稀释，管道预充应用羟乙基淀粉130/0.4氯化钠注射液及复方乳酸林格液，晶胶比为1∶1～1∶1.5，甘露醇0.5 g/kg，并根据术前红细胞压积加入适量浓缩红细胞(150～300 ml),维持红细胞压积在25%～30%。灌注流量为2.2～3.0 L·min-1·m-2，灌注压维持在35～65 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，在体外循环下阻断升主动脉，在心脏停跳下手术，心肌保护采用冷晶体停跳液间断进行主动脉根部灌注，心包腔内置冰屑。中心降温控制直肠温度32～34℃。体外循环期间根据血气分析的结果和尿量，视情况给予碳酸氢钠、甘露醇、速尿、氯化钾、氯化钙等。主动脉插管前静脉给予肝素3 mg/kg,ECC前启动全血凝固时间(ACT)维持在480 s以上，复跳后辅助循环时间约为主动脉阻断时间的1/3。ECC结束后以鱼精蛋白1.2∶1～1.5∶1中和体内肝素。术中不用激素、抑肽酶、全血及超滤。

　　ECC时间42～64 min，平均为(54±10)min;主动脉阻断时间(20～40) min，平均(31±10) min，所有病例均痊愈出院。

　　1.4 标本采集及处理

　　全部患者分别于麻醉诱导后(T0)，停ECC即刻(T1)，术后第1天(T2)，术后第3天(T3)及术后第7天(T4)共5个时间点采取静脉血标本5 ml，立即置入肝素抗凝管中。

　　细胞涂片制备：取肝素抗凝的静脉血2 ml，缓冲液(PBS)稀释1～2倍后，沿装有等量淋巴细胞分离液的试管壁混匀缓慢加至液面上层，保持两种液体界面清晰，离心(2 000 r /min)15～20 min，吸取两液面交界处的单个核细胞层，加5倍PBS，离心(1 000 r/min)5 min，弃上清夜，沉淀即为单个核细胞。利用试管中剩余的少许回流液体(约1滴)混匀细胞，制成单个核细胞悬液。滴30 μl细胞悬液于载玻片上，吸去液体，快速吹干或37℃温箱1 h烤干。或用PBS将单个核细胞调至2×105个/ml，离心涂片机1 000 r/min离心1～2 min制片，快速吹干或37℃温箱1 h烤干。涂片前取防脱片剂5～10 μl均匀推片，亦可用棉签拈取防脱片剂均匀涂于干净载玻片上，待干后制备细胞涂片，以防脱片。制好的涂片用于免疫细胞化学和组织化学AgNORs染色。

　　1.5 检测步骤

　　1.5.1 免疫细胞化学染色步骤：充分干燥(室温2 h以上或过夜)的细胞涂片先用记号笔在标本外画圈，然后滴加固定液50 μl，室温静置2～3 min，用PBS淋洗，擦干载玻片背面及细胞外的液体(以上在湿盒中进行)。分别滴加CD3、CD4、CD8单克隆抗体适量(10～30 μl)，4℃过夜，PBS淋洗3次。滴加生物素标记小鼠IgG适量(10～30 μl)，37℃孵育30～45 min，PBS淋洗3次。滴加碱性磷酸酶标记链霉卵白素适量(10～30 μl)，37℃孵育30～45 min，PBS淋洗3次。滴加显色剂30～50 μl，室温显色20～40 min。可在显微镜下观察，待细胞膜上出现红色标记物时，用PBS淋洗。滴加细胞核复染液30～50 μl，30 s后自来水淋洗。滴加封片剂，盖片封片，镜检。

　　1.5.2 AgNORs染色：载玻片上滴加新鲜配制硝酸银染液150～200 μl，然后放到湿盒内(直径13.5 cm，含50 ml水)，置于微波炉内，90 W状态，作用3 min，停3 min后取出。将载玻片放人蒸馏水中漂洗2 min，4次。1% Famer液处理数秒，注意密切观察颜色变化，反应时间长了会脱掉颜色。蒸馏水清洗，逐级酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

　　1.5.3 结果判定： 1996年关于AgNORs研究工作的标准化方案，结合BA600全自动数码显微镜图像分析系统进行(MED 6.0 B软件)镜下随机计数200个细胞内AgNORs的数量。

　　1.6 统计学分析

　　应用SPSS 13.0统计软件,计量资料以±s表示，不同时点的组内比较采用重复测量数据的方差分析(ANOVA);应用Pearson分析法进行相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 免疫细胞化学染色证实

　　CD3、CD4、CD8抗原表达均在相应细胞的细胞膜上。见图1～3。与麻醉诱导后比较，CD+3在停ECC即刻及术后第1天、术后第3天时均显著降低(P<0.01)，术后第1天降到最低值，术后第3天时回升，术后第7天时恢复至麻醉诱导后水平 (P>0.05);与麻醉诱导后比较，CD+4在停ECC即刻时降低(P<0.05)，第1天、术后第3天时均显著降低(P<0.01)，术后第1天降到最低值，术后第3天时回升，术后第7天时恢复至麻醉诱导后水平(P>0.05);与麻醉诱导后比较，CD+8在停ECC即刻、术后第1天、术后第3天术后及第7天时均无显著变化(P>0.05);与麻醉诱导后比较，CD+4/CD+8术后第1天显著降低(P<0.01)，术后第3天即恢复到麻醉诱导后水平(P>0.05)。见表1。

　　2.2 AgNORs 变化情况

　　形态类型为单一型，大都呈规则的圆形，ECC前后形态无变化。见图4。与麻醉诱导后比较，AgNORs的数量变化差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。图1 CD+3免疫组织化学染色(20×3.3倍，AEC显色)图2 CD+4免疫组织化学染色(20×3.3倍，AEC显色)图3 CD+8免疫组织化学染色(20×3.3倍，AEC显色)图4 AgNORs嗜银蛋白染色(20×3.3倍)表1 T细胞亚群的免疫组织化学染色数据表2 AgNORs染色数据

　　3 讨论

　　先天性心脏病(congenital heart disease，CHD)是因胎儿期心脏发育畸形所致的常见疾病，国内报道在出生活婴儿发病率为约6.7‰，年长儿约为2‰～3‰。室间隔缺损占CHD的一定比例。目前ECC下心内直视手术是纠治CHD的一种重要方法，作为一种非生理性循环，对机体的各器官系统均有一定的不良影响，包括免疫系统。单个核免疫细胞主要包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞及自然杀伤(NK)细胞等。我们的研究结果，成熟T细胞和Th细胞与麻醉诱导后比较，停ECC即刻即明显降低，术后1 d降到最低点，术后3 d回升但仍处于较低水平，7 d就已经恢复至术前水平，这与国外报道的时间相似[2]。比国内报道的时间(7 d回升，14 d才能恢复正常水平)稍短[3]。本研究并未发现ECC造成Tc细胞的显著变化，只是有轻度升高。国内有人发现Tc细胞在ECC开始后升高，术后1～7 d渐下降至正常水平。国外亦有证实，ECC后Tc细胞升高。上述研究的差别有可能与采取的实验方法、ECC方法、ECC装置的不断改善、ECC转流时间缩短、术中出血量和输血量明显减少、小切口技术使手术损伤减小等因素有关。Th/Tc比值明显下降，Tc细胞变化不显著，因此我们认为Th细胞减少是成熟T淋巴细胞细胞数量减少和Th/Tc比值下降的主要因素。说明ECC后VSD患者既存在T细胞免疫功能的降低，增加了术后患儿对某些病毒、细菌、真菌等的易感性。在机体效应T细胞减少、对外界病原微生物感染的免疫应答作用减弱时，非特异性免疫应答可能具有更重要的意义，借以维持机体免疫应答的相对稳定状态[4]。因此，如能够作为一项重要指标在体外循环前后合理监测T淋巴细胞亚群的变化，将有助于及早采取有效措施改善患儿免疫功能状态。为了证实检测的细胞未从数量变化发生本质变化，即增殖到恶变，这是进行T淋巴细胞亚群免疫组织化学染色检测的前提，保证淋巴细胞的功能和免疫表型等的一致性。目前，ECC对免疫细胞AgNORs的研究尚未见相关报道。AgNORs是与细胞增殖活动功能有关的一类蛋白，是存在于细胞核内具有调节rRNA转录作用的高度磷酸化非组蛋白，从其颗粒数目、大小及形态变化，能够从分子病理学水平反映细胞核DNA活性及动力学变化[5，6]。其含量是反映细胞增殖状态的重要指标，含量越高表明细胞增殖越快。AgNORs 的含量可以反映rDNA 转录活性的高低，此含量可通过银染核仁面积与细胞核面积的比值高低来反应[7]。本研究所分析的是单个核免疫细胞的AgNORs 数量，由于淋巴、单核、NK细胞的细胞核面积基本一致，离心后处于相同的密度梯度范围(形态、质量相当)，因此我们通过测定上述细胞的细胞核直径，按照许良中提出的标准，计算出AgNORs个数/细胞核，可以直接反映银染核仁面积与细胞核面积的比值，减少了计算误差，而且更加直观。本研究发现小儿ECC前后单个核细胞核内AgNORs颗粒大都呈规则的圆形，数量多是1个，少数可见2个;AgNORs数量变化不明显，从分子病理学水平证明ECC并未对小儿单个核细胞的核仁分解、融合、染色体的倍体数增加和rDNA转录活动增加等功能造成影响。这种现象的原因主要可能是单个核细胞在ECC过程中因机械手术创伤被大量破坏，在ECC术后通过循环回流机制重新分布于机体其他淋巴器官如骨髓、肝、脾、淋巴结等;所以对单个核免疫细胞不会造成增殖抑制，也不会引起异常增生和恶变。

　　总之，在AgNORs正常的情况下，小儿VSD在 ECC下心内直视术后第1～3天CD+3、CD+4与麻醉诱导后比较均显著下降，可以看到CD+4下降明显，CD+8无显著变化，致使CD+4/CD+8比值显著下降。说明VSD患儿既存在细胞免疫功能的降低，又存在调节功能失调，增加了术后患儿对某些病毒、细菌、真菌等的易感性。因此，应积极采取增强机体免疫力的方法和减少免疫抑制剂的应用等有效措施，从而改善患儿免疫功能状态，增加抗感染能力，并结合临床规范化治疗减少VSD小儿围ECC期并发症的发生，进一步降低病死率。

　　【参考文献】

　　1 Laffey JG,Boylan JF,Cheng DC.The systemic inflammatory response to cardiac surgery：Implications for the anesthesiologist.Anesthesiology,2002,97：215252.

　　2 Yamaguchi T,Murakami A,Fukahara K,et al.Changes in Tcell receptor subsets after cardiac surgery in children.Surgery Today,2000,30:875.

　　3 郭巍，邹承伟，王安彪，等.西咪替丁对体外循环手术患者免疫功能的保护作用.中国胸心血管外科临床杂志,2007,14:97100.

　　4 刘韵蝉，马莉.老年下呼吸道感染患者外周血细胞免疫表型分析.贵阳医学院学报，2009，34：4749.

　　5 Crocker J,Egan MJ.Correlation between DNA flow cytometric and nucleolar organizer region date in nonHodgkin’s lymphomas.J Pathol,1998,154:151156.

　　6 Hall PA,Crocher J,Watts A,et al.Comparision of nucleolar organizer region staining and Ki67 immunostaining in nonHodgkin’s lympomas.Histopathology,1988,12:373381.

　　7 Chiusa L,Galliano D,Formiconi A,et al.High and low risk prostate carcinoma determind by histologic grade and proliferative activity.Cancer,1997,79:19561963.