重症脓毒症患者外周血单核细胞mCD14和HLADR的表达及临床意义

　　【摘要】 目的 观察重症脓毒症患者外周血单核细胞(PBMC)脂多糖受体(mCD14)、HLADR的表达变化及临床意义。方法 选取符合重症脓毒症患者35例和健康志愿者15例作为对照。按预后分为生存组(25例)和死亡组(10例)，用流式细胞仪检测PBMC表面mCD14、HLADR在病后不同时间的动态改变。结果 死亡组PBMC表面mCD14、HLADR各点均显著低于正常对照组(P<0.01)，生存组mCD14在 0～24 h明显低于正常对照组(P<0.01)，48、72 h恢复正常对照组水平;HLADR在 0～48 h均低于正常对照组，72 h逐渐升高但仍未恢复正常对照水平，0～24 h生存组与死亡组mCD14表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，第48、72小时生存组明显高于死亡组(P<0.05或<0.01);0～48 h生存组与死亡组HLADR表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，第72小时生存组明显高于死亡组(P<0.05)。结论 重症脓毒症患者单核细胞呈抑制状态，不同预后患者其免疫功能恢复时mCD14恢复早于HLADR。

　　【关键词】 mCD14,HLADR,重症脓毒症,外周血单核细胞

　　【Abstract】 Objective To observe the change of expresion of mCD14,HLADR in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) in patients with severe sepsis and its clinical meaning.Methods Thirtyfive patients with severe sepsis and fifteen healthy volunteers were enrolled in this investigation.The thirtyfive patient were divided into survival group (n=25) and nonsurvival group (n=10),and fifteen healthy volunteers were served as control group.The expression of mCD14 in PBMC was detected by flow cytometry.Results The expression of mCD14,HLADR in PBMC in nonsurvival group was significantly lower than that in control group at every spot(P<0.01),however, the expression of mCD14 in survival group was significantly lower than that of control group at 0h, 12h,24h,while it returned to the normal range at 48h,72h. The expression of HLADR in nonsurvival group was significantly lower than that of control group at 0h,12h,24h,48h,however,it returned to the normal range at 72h. There were no significant differences in the expression of mCD14 at 0h,12h,24h between nonsurvival group and survival group (P>0.05), but in survival group it was significantly higher than that in nonsurvival group at 48h,72 h(P<0.05 and P<0.01). There were no significant differences in the expression of HLADR at 0h,12h,24h,48h between nonsurvival group and survival group,however,in survival group it was significantly higher than that in nonsurvival group at 72h(P<0.05).Conclusion The peripheral blood mononuclear cells show a suppressive state in patients with severe sepsis,and the recovery of mCD14 is earlier than that of HLADr in patients with different prognoses during their immune function recovery.

　　【Key words】 mCD14;HLADR;severe sepsis;peripheral blood mononuclear cell

　　随着人们对脓毒症病理生理机制的研究,特别是认识到机体免疫状态紊乱在脓毒症的发生、发展中起到重要作用。Volk等[1，2]证明，以CD14+单核细胞人类白细胞抗原(HLADR)<30%为阈值能够可靠地筛选出脓毒症免疫抑制的患者。而CD14、HLADR在重症脓毒症不同预后各时间点表达变化及临床意义尚未见报道。本实验旨在观察重症脓毒症免疫状态不同预后患者单核细胞mCD14与HLADR的表达变化，探讨其临床意义，以期进一步了解mCD14、HLADR在重症脓毒症中的作用。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　2007年3月至2009年8月河北省邯郸市中心医院ICU符合重症脓毒症患者35例，其中男19例，女16例;年龄33～91岁，平均年龄(70±11)岁。15例健康志愿者为正常对照组，男8例，女7例;年龄43～83岁，平均年龄(68±11岁，2组性别比和年龄构成比较差异无统计学意义(P>0.05)。

　　1.2 诊断标准

　　符合2001年12月“国际脓毒症定义会议”推荐标准[3]，严重脓毒症(severe sepsis);为合并器官功能障碍的脓毒症。

　　1.3 治疗方法

　　重症脓毒症患者均给予针对原发病的积极治疗及充分补液、抗感染、营养、对症等综合ICU治疗。综合ICU 治疗推荐《2008严重感染和感染性休克治疗指南》(surviving sepsis campaign，SSC)。入住ICU后给每位患者急性生理学和慢性健康状况评分Ⅱ(APACHEⅡ)、全身性感染相关器官功能衰竭评分(SOFA评分)及28 d后转归(死亡和存活);入科0、12、24、48、72 h各采取外周静脉血1 ml，健康志愿者一次采血1 ml，EDTAK2(乙二酸四乙酸二钾)普通抗凝，用流式细胞术均测PBMC表面 mCD14、HLADR表达，以荧光强度表示(FMI)，对照组1次采血作为正常基础值对照。

　　1.4 外周血单核细胞mCD14、HLADR的检测

　　(流式细胞技术) 流式细胞术具体操作步骤：取EDTAK2抗凝全血100 μl依次加入鼠抗人荧光标记单克隆抗体工作液CD14FITC、HLADRPE各20 μl,同时加入羊抗鼠 FITCIgG和羊抗鼠PEIgG二抗工作液20 μl做阴性对照。避光室温孵育30 min，用溶血剂溶血，溶去红细胞。流式细胞仪检测采用FSC和SSC设门，测定10 000个单核细胞中mCD14、HLADR表达百分率。用Expo32ADC进行免疫荧光数据分析。

　　1.5 统计学分析

　　应用SPSS 13.0统计软件，所有资料均采用正态性检验，正态分布的计量资量以±s表示，组间比较采用两样本均数t检验，组内比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 35例死亡10例，生存25例。35例中肺部感染26例，胆道感染4例，腹部感染5例，微生物培养阳性26例，G-菌14例，混合感染5例，G+菌7例，1个脏器衰竭2例，2个15例，余3个以上脏器衰竭，APACHEⅡ平均(19±9)分,SOFA平均(9.27±3.90)分，28 d 病死率28.6%(10/35例)。

　　2.2 正常对照组外周血单核细胞

　　mCD14表达水平(5.57±1.53)，死亡组各点(0、12、24、48、72 h)均显著低于正常对照组(t=5.021、3.601、4.064、3.231、5.445，P<0.01)，生存组 0～24 h明显低于正常对照组(t=5.385、5.523、4.102，P<0.01)，48、72 h恢复正常对照组水平(t=0.479、0.722，P>0.05)。0～24 h 2组mCD14表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，第48、72 小时生存组明显高于死亡组(P<0.05或<0.01)，生存组内48、72 h明显高于0～24 h(P<0.01), 死亡组内各点差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。表1 2组不同预后各点外周血单核细胞

　　2.3 正常对照组外周血单核细胞

　　HLADR表达水平(59±15)，死亡组各点(0、12、24、48、72 h)均显著低于正常对照组(t=10.719、10.692、10.525、9.013、8.769，P<0.01)，生存组在各点明显低于正常对照组(t=14.68、15.087、15.622、10.045、4.360，P<0.01)，72 h明显升高，但并未恢复正常对照组水平。0～48 h生存组与死亡组 HLADR表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，第72小时生存组明显高于死亡组(P<0.05)。生存组内72小时明显高于0～48 h(P<0.01), 死亡组内各点差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。表2 不同预后2组各点外周血单核细胞 HLADR表达水平及组内比较

　　3 讨论

　　研究表明，CD14作为脂多糖(Lipopolysaccharde，LPS) 的重要受体，在TLR4的信号传导通路[4]中与脂多糖结合蛋白(LBP)共同作用可明显提高各种细胞对内毒素的敏感性，是内毒素的生物活性提高数百倍甚至数千倍，在炎性反应、脓毒症等病理反应中起重要作用[5]。 CD14以两种形式存在，即膜性 CD14(mCD14) 和可溶性CD14(sCD14)。mCD14是髓源性细胞的分化抗原，存在于单核巨噬细胞膜表面、分子量为55 000的鞘糖脂肌醇连接蛋白。它是成熟单核细胞的标志物,主要表达在成熟的单核细胞表面[6]，sCD14无GPI结构，存在于血清、尿液中和培养mCD14阳性细胞的上清液中，由mCD14脱落或细胞分泌产生。sCD14/LPS复合物能结合CD14阴性细胞(如内皮细胞和上皮细胞)，使这些细胞分泌细胞因子。sCD14是LPS作用于CD14阴性细胞的重要途径[7]。本实验中在入科0～24 h所有患者外周血单核细胞表面mCD14表达显著低于正常人，且基本保持在同一水平，其原因可能为LPS在刺激mCD14产生的同时，又可使部分mCD14从细胞表面脱落为sCD14所致，mCD14的脱落是一种调节机制，而这种调节可能导致单核细胞功能抑制，产生炎性因子的能力减弱。而生存组在第48、72小时恢复正常对照水平并明显高于本组0～24 h及死亡组，说明生存组48、72 h单核细胞表面mCD14脱落现象可能得到改善，单核细胞功能尚在可调节范围，而死亡组各时间点mCD14表达持续在低水平且明显低于正常，可能与mCD14持续脱落，其功能不能及时恢复，导致了不良预后。

　　HLADR抗原在人类单核细胞是最常见的表达区域，在TLR4引起内毒素的信号转导通路中，最终启动特异性免疫系统，释放TNFα等炎性因子。传统方法认为，CD14+单核细胞HLADR表达<30%时，提示单核细胞免疫麻痹免疫功能低下[1]。本实验中各时间点外周血单核细胞HLADR表达均<30%且显著低于正常人，说明2组患者无论生存组、死亡组均存在单核细胞免疫麻痹，生存组在第72小时明显高于本组0～48 h及死亡组，但未能恢复到30%以上，也低于正常人。这可能与观察时间较短有关，而死亡组各时间点HLADR表达持续在低水平，说明单核细胞免疫麻痹持久不能恢复。本实验还观察到生存组内mCD14恢复早于HLADR，mCD14在第48小时恢复正常，HLADR在第72小时才逐渐升高，是否可能与TLR4介导LPS引发一系列的胞内信号转导中mCD14反应早于抗原呈递细胞HLADR有关，原因还有待于进一步研究，本实验中所有患者APACHEⅡ>18分以上，SOFA>9分以上，且2组在治疗前APACHEⅡ、SOFA评分差异无统计学意义，说明病情轻重无差异，而预后是不同的，原因可能与宿主本身对感染所致的重症脓毒症不同的反应有关。

　　【参考文献】

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　　4 Miyake K.Innate recognition of lipopolysaccharide by Tolllike receptor 4 MD2 Trends Microbiol, 2004,12:186192.

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