姜黄素对糖尿病大鼠肾脏保护作用的机制研究

　　【摘要】 目的 探讨姜黄素对实验性糖尿病大鼠肾脏基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2，MMP2)及其抑制物金属蛋白酶2组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase2，TIMP2)表达的影响。方法 大鼠随机分为正常对照组(A组)、糖尿病组(B组)及姜黄素治疗组(C组),采用腹腔单剂量注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)65 mg/kg建立糖尿病大鼠模型。治疗组给予姜黄素30 mg·kg1·d1腹腔注射。实验第3、6周各组分别宰杀6只大鼠，并检测24 h尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate，UAER)、肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr)及肾重/体重。采用免疫组织化学染色法检测肾小球MMP2、TIMP2、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)和Ⅳ型胶原表达。结果 治疗组大鼠UAER(P<0.05或<0.01)、Ccr(P<0.05)、肾重/体重(P<0.05)均明显低于糖尿病组大鼠。免疫组织化学染色可见糖尿病大鼠肾小球TIMP2、 FN和Ⅳ型胶原表达均明显增加(P<0.05或<0.01)，治疗组上述指标的表达均受到明显抑制(P<0.05)。MMP2在糖尿病大鼠肾小球的表达明显被抑制(P<0.01)，治疗组其表达明显增加(P<0.05)。结论 姜黄素通过上调糖尿病大鼠肾小球MMP2表达、下调TIMP2表达，对糖尿病大鼠肾脏病变具有保护作用。

　　【关键词】 糖尿病肾病,姜黄素,基质金属蛋白酶2,金属蛋白酶2组织抑制物

　　【Abstract】 Objective To investigate the action mechanism of protective effects of curcumin on kidney of experimental diabetic rats,by observing the effects of curcumin on the expression of matrix metalloproteinase2 (MMP2) and tissue inhibitor of metalloproteinase2 (TIMP2) in kidney of experimental diabetic rats.Methods The rats were randomly divided into normal control group( group A),diabetes group(group B) and curcumin treatment group (group C),The rat models of diabetes were established by intraperitoneal injection with curcumin 60mg/kg.The rats in curcumin treatment group were given curcumin 30mg·kg1·d1 intraperitoneally.The UAER,Ccr and the ratio of kidney weight/body weight were detected after 3week and 6week treatment,and the expressions of MMP2,TIMP2,FN and collagen Ⅳ were measured by immunohistological staining.Results The UAER,Ccr and the ratio of kidney weight/body in group C were significantly lower than those in group B (P<0.05 or P<0.01).As composed with those in group C,the protein expressions of TIMP2,FN and collagen Ⅳ were significantly increased in glomeruli of the rats in group B(P<0.05 or P<0.01).The expression of MMP2 was significantly decreased in group B,however,which was obviously increased in group C(P<0.05).Conclusion The curcumin has protective effects on the kidney of experimental diabetic rats by upregulating the expression of MMP2 and downregulating the expression of TIMP2 in glomeruli of diabetic rats.

　　【Key words】 diabetic nephropathy; curcumin; matrix metalloproteinase2; tissue inhibitor of metalloproteinase2

　　肾组织内的肾素血管紧张素系统(reninangiotension system，RAS)在糖尿病肾病的发生及病情进展中起重要作用，高糖可在肾组织局部激活该系统，导致血管紧张素Ⅱ(angiotension Ⅱ，AngⅡ)产生增加，AngⅡ通过与肾组织内存在的受体AT1R结合，刺激肾组织表达基质金属蛋白酶2(MMP2)与其抑制物TIMP2的比例失衡，导致细胞外基质降解减少[1，2]。本研究通过观察糖尿病大鼠肾小球内MMP2和TIMP2的表达及姜黄素对其表达的影响，探讨姜黄素的肾脏保护机制，为临床防治糖尿病肾病提供实验性理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物模型制备

　　雄性SD大鼠36只，体重180～220 g(购自河北医科大学实验动物部)，大鼠腹腔单剂量注射STZ(购自Sigma公司)65 mg/kg，对照组仅注射等量柠檬酸缓冲液。72 h后尾静脉采血，使用OneTouchⅡ血糖仪(强生公司生产)测全血血糖，血糖≥16.7 mmol/L确定为糖尿病大鼠。

　　1.2 动物分组及给药

　　大鼠随机分为3组，即正常对照组(A组)、糖尿病组(B组)及糖尿病姜黄素治疗组(C组)，每组12只。姜黄素溶于6%乙醇和6%聚乙二醇混合液中，自造模当天起腹腔注射30 mg·kg-1·d-1，A组与B组分别给予等量6%乙醇和6%聚乙二醇混合液腹腔注射。大鼠自由饮水、进食，不使用胰岛素及其他降糖药物。于实验第3、6周各组分别取6只大鼠宰杀。

　　1.3 标本收集

　　宰杀前1 d用代谢笼收集24 h尿液，计量后分别取6 ml，3 000 r/min离心5 min，去除沉渣，保存于-20℃冰箱待测24 h尿白蛋白排泄率(UAER)、尿肌酐。大鼠称重，断头取血5 ml，3 000 r/min离心5 min，分离血清，测定血糖、尿素氮及血肌酐。取双肾，去掉包膜称重，取部分右肾皮质置于10%中性福尔马林溶液浸泡固定，待HE、PAS及免疫组织化学染色检查。

　　1.4 生化指标检测

　　尿白蛋白检测用放射免疫法(药盒购自中国原子能科学研究所)。生化指标检测采用日立7150全自动生化分析仪，并计算肌酐清除率(Ccr)，结果用体重校正。

　　1.5 免疫组织化学染色

　　采用SP法。石蜡切片厚4 μm。阴性对照用1%BSA代替一抗，检测MMP2、TIMP2、FN和Ⅳ型胶原的表达。结果采用HPIAS1000病理图像分析系统进行半定量分析，每张标本随机选5个视野，计算每个视野内染色区域的平均吸光度，以均值计算每个标本的吸光度，最后以每组的均值进行比较。

　　1.6 统计学分析

　　应用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差分析，计量资料以±s表示，采用t检验，两两比较用SNK法，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 3组大鼠体重、肾重、肾重/体重及血糖的比较

　　注射STZ后大鼠血糖上升，72 h后血糖≥16.7 mmol/L，说明糖尿病模型成功。同期各组相比，B组大鼠体重均低于A组(P<0.05或<0.01)，并呈进行性下降，肾重、肾重/体重均逐渐增加，与A组比较差异有统计学意义(P<0.05)。C组体重均高于B组(P<0.05)，肾重、肾重/体重均低于B组(P<0.05)。见表1。表1 3组大鼠体重、肾重、肾重/体重及血糖比较

　　2.2 3组大鼠肾功能及UAER的变化

　　同期大鼠相比，B组大鼠血尿素氮、Ccr及UAER明显高于A组(P<0.05或<0.01)。C组血尿素氮、Ccr及UAER均低于同期B组(P<0.05)。见表2。　表2 3组大鼠生化指标及UAER的比较

　　2.3 3组大鼠肾小球表达MMP2、TIMP2、纤维连接蛋白(FN)及Ⅳ型胶原蛋白的比较

　　在A组可见MMP2蛋白主要在肾小球系膜及基底膜表达，于第3、6周相比无明显变化;B组MMP2蛋白在肾小球的表达与同期A组相比明显被抑制(P<0.01),并呈进行性降低;C组MMP2蛋白在肾小球的表达与同期B组相比明显增加(P<0.05)。A组可见肾小球系膜和基底膜少量表达TIMP2、FN和Ⅳ型胶原蛋白，第3周与第6周相比无明显变化;B组上述指标与同期A组相比均逐渐增加(P<0.05或<0.01);C组上述指标与B组相比均受到明显抑制(P<0.05)。见表3。表3 3组大鼠肾小球表达MMP2、TIMP2、FN及Ⅳ型胶原蛋白的比较

　　2.4 3组大鼠肾组织病理学改变

　　光镜结果显示：A组大鼠肾小球血管袢薄而清晰，小管结构正常，未见病理改变;B组大鼠肾小球面积增大，肾小球系膜区增宽、基底膜增厚，病变呈进行性，肾小管病变不明显，且未见肾小球硬化;C组大鼠肾小球病理改变较B组明显减轻，但仍重于A组。

　　3 讨论

　　本研究采用SD大鼠腹腔注射STZ诱导糖尿病模型成功，72 h后测血糖≥16.7 mmol/L。在第3、6周检测到肾重/体重呈进行性升高，光镜观察可见肾小球面积增大、系膜基质增多及基底膜增厚，说明本模型已出现糖尿病肾病早期的病理改变。肾组织内细胞外基质堆积与高糖环境密切相关。高糖激活肾组织内的RAS系统，使AngⅡ产生增加，其通过与肾组织内广泛存在的AT1R受体结合，导致肾小球系膜细胞和脏层上皮细胞分泌基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)活性降低，分泌基质金属蛋白酶家族抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)活性升高，导致细胞外基质降解减少，引起系膜基质堆积、系膜区扩大及基底膜增厚[3，4]。

　　MMPs为锌依赖的蛋白酶，以前体的形式被分泌出来，通过蛋白水解作用去掉覆盖活性部位的前体肽片段而被激活。活化的MMPs可被特异抑制物其所对应的TIMPs以1∶1的方式所抑制。MMP2是MMPs中的重要一员，可降解系膜及基底膜的Ⅳ型胶原、FN及层粘连蛋白。细胞外出现的TIMP2以1∶1的方式在低剂量时促进MMP2激活，在表达过量时则抑制其激活[3，5，6]。

　　本实验于第3、6周均发现糖尿病大鼠肾小球MMP2表达减少，TIMP2增加相应表达，肾小球细胞外基质堆积，与文献报道一致。姜黄素治疗组大鼠肾小球表达MMP2明显增加，并显著抑制肾小球表达TIMP2，明显降低FN及Ⅳ型胶原蛋白表达，从而减轻肾小球细胞外基质堆积。

　　本实验证实，姜黄素通过上调糖尿病大鼠肾小球表达MMP2，下调其表达TIMP2，促进FN及Ⅳ型胶原蛋白降解，减少细胞外基质堆积，改善肾功能，减轻肾皮质损伤。由于B、C 2组大鼠血糖无差异，所以该药的肾脏保护作用与代谢因素无关

　　【参考文献】

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　　2 Ji L，Yin XX，Wu ZM，et al.Ginkgo biloba extract prevents glucoseinduced accumulation of ECM in rat mesangial cells.Phytother Res，2009，23：477485.

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　　5 Thrailkill KM，Bunn RC，Fowlkes JL.Matrix metalloproteinases：their potential role in the pathogenesis of diabetic nephropathy.Endocrine，2009，35：110.

　　6 Wei S，Xie Z，Filenova E，et al.Drosophila TIMP is a potent inhibitor of MMPs and TACE：similarities in structure and function to TIMP3.Biochemistry，2003，42：1220012207.