脂联素对人脐静脉内皮细胞保护作用的实验研究

　　【摘要】 目的 体外培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)，加入低密度脂蛋白(LDL)建立细胞损伤模型，观察脂联素(APN)对模型细胞结构和功能的影响。方法 观察对照组、LDL损伤组、APN预处理组和APN干预组内皮细胞(EC)的形态改变，测定细胞活性，测定细胞培养上清中一氧化氮(NO)、乳酸脱氢酶(LDH)和6酮前列腺(6ketoPGF1) 的含量变化,测定细胞中一氧化氮合酶(NOS)的含量。结果 与正常细胞对照组比较，LDL损伤组的细胞形态明显改变,细胞存活率明显降低，LDH释放明显增高，NO、NOS和6ketoPGF1 合成明显降低(P<0.01);而APN预处理组和干预组能明显降低LDH释放，促进NO、NOS和6ketoPGF1 合成(P<0.01)。结论 APN对EC有一定的保护作用，能拮抗LDL对EC的损伤。

　　【关键词】 脂联素,脐静脉血管内皮细胞,一氧化氮,一氧化氮合酶,乳酸脱氢酶,6酮前列腺素

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of lipoprotein (LDL) on the cultured human umbilical vein endothelial cells (ECs) damage models established by adding lowdensity lipoprotein (LDL) in vitro and to observe the effect of adiponectin (APN) on the Ecs.Methods The cultured ECs were divided into five groups. GroupⅠ: normal Ecs; groupⅡ: ECs damaged by LDL;group Ⅲ:ECs cocultured with APN;group Ⅳ:LDL injuried model pretreated with APN;group Ⅴ:LDL injuried model treated with APN. The morphological changes and survival rate of the ECs were observed, and the levels of nitric oxide (NO),nitric oxide synthase (NOS), lactate dehydrogenase (LDH) and 6keto prostaglandin (6ketoPGF1 ) were detected.Results As compared with the normal ECs, the cell morphous in LDL injury group were significantly changed,and the survival rate was significantly lower,and the levels of LDH were significantly increased,however,the levels of 6ketoPGF1,NO and NOS were significantly decreased(P<0.01).When the ECs pretreated or treated with APN,the release of LDH was inhibited,and the synthesis of 6ketoPGF1, NO and NOS was obviously enhanced(P<0.01).Conclusion The APN has certain protective effect,which can relieve the damage of LDL on EC.

　　【Key words】 adiponectin;human umbilical vein endothelial cells;nitric oxide;nitric oxide synthase;lactate dehydrogenase;6keto prostaglandin

　　脂联素(adiponectin，APN)是近些年来发现的一种由脂肪组织分泌的蛋白质类激素[1,2]，参与机体的脂肪代谢和能量平衡的调节，与肥胖、糖尿病、高血压及脂代谢紊乱的发生密切关联[3-5]，APN已成为心脑血管疾病的研究热点。研究发现脂肪组织的增多及脂肪细胞因子分泌的异常对于胰岛素抵抗及血管功能异常的发生起了重要作用，其中作为脂肪因子的APN由于具有胰岛样血管活性作用以及抗动脉粥样硬化和抗炎作用而倍受关注[6]。深入研究APN血管活性作用及其作用机制，可为心脑血管疾病、糖尿病、代谢综合征的临床研究提供新的思路。为此，我们利用体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，建立LDL损伤细胞模型，观察APN对模型细胞的作用，介绍如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　APN购自北京博奥森科技生物技术有限公司;LDL、HDL由卫生部老年医学研究所生化室惠赠;HUVEC、RPMI1640培养基(美国Gibco公司产品)购自清源昊生物科技有限公司;胰蛋白酶(美国Sigam公司产品)，配制成0.25%浓度，除菌备用;MTT[溴化-3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑]为Sigma(美国)产品，用0.01 mol/L PBS配成5 mg/ml，除菌、4 C避光备用;DMSO(二甲基亚砜)购自北京化学试剂公司。一氧化氮(NO)、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒购自北京瑞博赛生物技术有限公司;6ketoPGF1a放免试剂盒购自北京东亚免疫研究所。蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、一氧化氮合酶(NOS)鼠抗人一抗、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗购自北京经科宏达生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 人脐静脉血管内皮细胞(EC)的体外培养:培养HUVEC，当细胞达到85%～90%融合时,用0.25%胰蛋白酶消化,5 min后加牛血清终止，用滴管轻轻吹起细胞，放入离心管中，1 500 r/min离心5min，弃上清，加含有20%牛血清的RPMI1640培养基，接种到12孔或96孔细胞培养板中，置37 ℃，5% CO2孵箱中培养。

　　1.2.2 实验分组:试验分5组，每组设重复3孔。Ⅰ 组：对照组;Ⅱ组：LDL组(20 μl LDL，100 g/ml);Ⅲ组:APN组 (20 μl APN，100 g/ml);Ⅳ组:APN预处理组(20 μl APN，100 g/ml预处理EC 4 h后加20 μl LDL,100 g/ml);Ⅴ组：APN干预组( 20 μl LDL,100 g/ml 4 h后加20 μlAPN，100 g/ml)。分别于细胞培养的24、4 h观察细胞形态，测定细胞活性，测定细胞培养上清中NO、NOS、LDH和6ketoPGF1 含量。

　　1.2.3 细胞形态学观察和活性测定:倒置显微镜观察各组EC的一般形态学。各组EC分别接种到96孔细胞培养板中，每孔100 μl，置37 C,5%CO2孵箱中培养。于细胞培养的24、48 h，分别加MTT溶液，每孔20 μl，继续培养6 h，离心1000r/min，15 min，弃上清，轻轻扣板于滤纸上，吸去多余液体。每孔加入DMSO 100 μl，振荡混匀后，用酶标仪在570 nm处测定各孔吸光度(A值)。按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率=实验组A570 nm值对照组A570 nm值×100%

　　1.2.4 培养上清NO、LDH和6ketoPGF1 含量分析:各组EC分别接种到12孔细胞培养板中，每孔1ml，置37℃,5%CO2孵箱中培养。于细胞培养48 h收集上清，分别用分光光度法、速率法和放射免疫法测定细胞培养上清中NO、LDH和6酮前列腺(6ketoPGF1 ) 的含量变化，所有步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

　　1.2.5 Westernblot法测定细胞中NOS的含量:用蛋白试剂盒从各组的EC细胞提取总蛋白，BCA法检测蛋白质的含量，50 μg上样量分别用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶进行垂直电泳分离，转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉封闭2hr，按1∶200稀释NOS鼠抗人一抗4℃过夜，TBST洗涤3次，将膜放于用TBST稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗中，室温轻摇2 h，用TBST洗涤3次，用ECL系统检测。以βactin作为内对照。

　　1.3 统计学分析

　　应用SPSS 11.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 形态学观察

　　在倒置相差显微镜下观察，Ⅰ组人脐静脉内皮细胞为单层生长，呈短梭状或鹅卵石样镶嵌排列，细胞核居中，呈椭圆形，核仁明显，细胞分布均匀，遍布瓶底;经LDL处理后，细胞出现不同程度的收缩变小，较多的细胞变圆脱落,有的细胞破碎且胞内可见空泡;预加入APN保护或用APN干预后，部分EC变圆脱落，与正常对照组比较，大部分EC的形态结构无明显变化(图1～4)。图1 正常内皮细胞(HE×100)图2 LDL损伤的内皮细胞(HE×100)图3 APN预保护的内皮细胞(HE×100)图4 APN干预的内皮细胞(HE×100)

　　2.2 细胞存活率测定

　　Ⅰ组细胞存活率最高Ⅱ组细胞的存活率最低(P<0.01)。Ⅲ组的EC与Ⅰ组比较，存活率有所下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅳ组的存活率略高于Ⅴ组，提示APN对EC具有一定的保护作用。见表1。表1 各组细胞存活率测定结果比较

　　2.3 细胞培养上清中NO、LDH和6ketoPGFLa测定结果

　　与Ⅰ组比较，培养48 h时Ⅱ组的NO水平明显降低，APN预处理组和干预组能明显抑制NO水平的降低，表明APN可以促进细胞NO的释放，从而对细胞损伤有一定的保护作用。与正常对照组比较，LDL损伤组LDH的值最高，而6ketoPGF1 的值最低，表明细胞的破坏程度最大，LDH的释放明显增高，抑制6ketoPGF1 的合成。加入APN后，LDH的升高明显降低，6ketoPGF1 的减少有所减轻，表明APN对EC的损伤有一定的保护作用。见表2。　　表2 EC培养上清NO、LDH和6ketoPGF1 测定值

　　2.4 Westernblot法测定细胞中NOS的含量

　　细胞培养48 h后，收集细胞，裂解后用Westernblot测定NOS蛋白的表达,见图5。1：对照组;2：LDL组;3:APN组;4:APN预处理组;5：APN干预组图5 各组培养细胞NOS蛋白的Westernblot结果

　　3 讨论

　　APN 是由脂肪细胞产生分泌的一种分子量为30 kD，含247个氨基酸的多肽，APN具有抑制血小板凝集、抗动脉粥样硬化、保护血管内皮细胞的氧化应激损伤等功能[7,8]。动脉粥样硬化动物模型证实，APN含量与三酰甘油和低密度脂蛋白成负相关，与高密度脂蛋白成正相关，APN对动脉粥样硬化病变的细胞具有一定的保护作用，其作用的机制与调节脂质代谢及影响血管内皮细胞分泌功能有关。为了进一步阐明APN对EC的作用及作用机制，我们建立了EC的损伤模型，进行了相关研究。

　　EC具有合成6ketoPGF1、释放LDH和NO的生理功能[9,10]。内皮细胞LDH漏出增加，说明细胞膜受到损伤，内皮细胞通透性升高，最终导致脂蛋白渗透到内膜下，从而促进动脉粥样硬化的发生发展;6酮PGF1α是PGI2的稳定降解产物，PGI2是由内皮细胞合成和分泌的，具有扩张血管和抑制血小板聚集作用;NO在调节内皮和维持内皮功能方面起重要作用[11]，NO对内皮具有“保护”和“损伤”双重作用。在体内，NO由NOS催化左旋精氨酸形成。NO大量生成可损伤内皮细胞的DNA，诱导细胞调亡。测定6ketoPGF1、LDH、NO及NOS含量的变化，可作为评价EC功能的指标。

　　我们的实验结果表明，LDL引起内皮细胞形态学发生变化，细胞皱缩，细胞间隙增大，细胞存活率降低;细胞培养上清中LDH含量上高，而NO和6ketoPGFLa含量降低;细胞中NOS合成降低，上述结果表明LDL对内皮细胞形态、代谢及功能均有直接损伤作用。与LDL损伤组比较，用APN预处理或干预细胞，部分细胞形态发生变化，呈不规则状，有部分细胞漂浮，细胞的存活率低于正常对照组，但优于LDL组;EC功能指标测定结果显示，LDH释放明显水平下降，6ketoPGFLa、NO及NOS水平明显升高，说明受LDL损伤的EC的结构与功能有所恢复。

　　我们通过体外实验研究证实，APN具有EC保护作用，能拮抗LDL对EC的损伤。随着对APN研究的不断深入，其与相关疾病的关系逐渐被认识，对于糖尿病、肥胖及心脑血管病等代谢综合征的防治具有一定的意义。

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