非小细胞肺癌中Tiam1的表达及与其脑转移的关系

　　【摘要】 目的 研究非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)中Tiam1的表达及与其淋巴结转移、脑转移的关系。方法 应用免疫组化法检测71例非小细胞肺癌组织标本中Tiam1的表达，并分析其临床意义。结果 Tiam1高表达与非小细胞肺癌的淋巴结转移及脑转移有关(P<0.05)。结论 检测Tiam1蛋白的表达，有可能为判断非小细胞肺癌淋巴结转移、脑转移的发生、发展提供依据。

　　【关键词】 Tiam1,非小细胞肺癌,脑转移

　　【Abstract】 Objective To observe the expression of Tiam1 and to investigate the relationship between Tiam1 expression and brain metastasis in nonsmall cell lung cancer (NSCLC).Methods The expressions of Tiam1 in 71 cases of NSCLC specimens were detected by immunohistochemical method.The clinical significance of Tiam1 expression in different types of NSCLC,lymph node metastasis and brain metastasis was analyzed.Results Tiam1 was highly expressed in 43 of 71 cases.There was no relationship among different types of NSCLC,but it was closely related with lymph node and brain metastasis(P<0.05),and it was a prognostic factor for brain metastasis in NSCLC.Conclusion Tiam1 is highly expressed in NSCLC,which may be useful as a predictor for lymph node and brain metastasis in patients with NSCLC.

　　【Key words】 Tiam1;nonsmall cell lung cancer;brain metastases

　　非小细胞肺癌(NSCLC)是常见的恶性肿瘤，发生率每年已达到76.1/10万(男)和30.6/10万(女)，分别位居男、女恶性肿瘤发病率的第1和第2位[1]，极大威胁着人的健康。超过1/3的肺癌患者存在脑转移，所以研究肺癌脑转移机制，阻断转移途径已成为临床防治的新方向。T淋巴瘤侵袭转移诱导基因1(Tiam1)是Habets等[2]于1994年从鼠的T淋巴瘤分离出来的一种肿瘤转移诱导基因，其产物Tiam1蛋白作为一种鸟苷酸转换因子，特异的激活Rac1，通过Tiam1Rac信号途径，改变肿瘤细胞的形态和功能，调节并诱导肿瘤的侵袭和转移。多项临床研究亦发现Tiam1 除在造血性肿瘤细胞系中如B细胞白血病和T细胞白血病表达，还在胃癌、乳腺癌、肾细胞癌、鼻咽癌、大肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌等非造血性肿瘤细胞系都有表达，并且表达水平根据肿瘤细胞侵袭转移能力的不同而不同，这说明Tiam1的转录能够诱导和提高肿瘤细胞侵袭转移[3-5]。本课题应用免疫组化法(immunohistochemical，IHC)研究非小细胞肺癌中Tiam1表达与临床分型、周围淋巴结转移、脑转移等的关系，寻找Tiam1的促转移机制，为临床通过阻断转移途径来预防和治疗肺癌颅内转移提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 一般资料

　　全部标本选自2004年2月至2005年1月河北医科大学第一医院、河北医科大学第四医院病理科，且证实为NSCLC的标本共71例，其中男43例，女28例;年龄35～79岁，平均年龄(56±10)岁，其中包括肺鳞癌37例、肺腺癌33例、细支气管肺泡癌1例。所有患者术前均未接受化疗、放疗和其他治疗。同期肺良性病变手术标本17例作对照。

　　1.2 试剂

　　兔抗人Tiam1(c16)蛋白单克隆抗体，工作浓度1∶100，由美国Santa Cruz公司提供。SP试剂盒(sp9000)为北京中山生物制剂有限公司的通用型产品。

　　1.3 方法

　　采用免疫组化染色方法SP法。步骤:石蜡切片脱蜡至水， PBS冲洗5 min 3次， 3%的过氧化氢甲醇液室温10 min，PBS冲洗5 min 3次，正常山羊血清工作液封闭10 min，滴加一抗室温过夜，PBS冲洗5 min 3次;滴加生物素标记二抗(IgG)工作液20 min，PBS冲洗5 min 3次，滴加链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶溶液37℃， 20 min， PBS冲洗5 min 3次，滴加DAB溶液，显微镜下观察3～10 min，苏木素复染，中性树胶固定，封片。以PBS代替一抗体作为阴性对照，已知阳性片作为阳性对照。

　　1.4 结果判断

　　阳性细胞为胞浆有棕黄色粗颗粒或细颗粒弥散分布，阳性判定以着色强度及阳性细胞数综合判断:着色强度分为，无色为0分、浅黄色为1分、棕黄色为2分;阳性细胞数分为，≤10%为1分、11%～50%为2分、51%～75%为3分、>75%为4分。两项得分相乘结果>3为阳性病例，≤3为阴性。最终结果是由两位病理医师用双盲法分别观察每例切片所获得的一致意见。定量数据处理：每个标本计数3张切片，在光镜下(10×40倍)每张切片上随机选取10个视野以真彩色图像分析系统(肾小球参数测量软件)分别测定平均光密度值，进行光密度法分析。

　　1.5 统计学分析

　　应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　在肺鳞癌细胞中，Tiam 1蛋白存在于癌细胞的胞浆中，呈现出黄褐色颗粒状物质，颜色浓淡不一(图1)，33例腺癌中18例表达阳性，阳性率为54.5%，在肺腺癌细胞中，Tiam 1蛋白同样存在于癌细胞的胞浆中(图2)，胞膜表达不明显，37例鳞癌中25例表达阳性，阳性率为67.6%，肺癌中鳞癌和腺癌2组差异无统计学意义(P>0.05)。在71例肺癌组织中Tiam 1蛋白染色有43例为阳性(43/71)阳性率为60.6%; 17例正常肺组织中Tiam 1蛋白染色为阳性有1例(图3)，阳性率5.9%，两者差异有统计学意义(P<0.05)。43例男性肺癌中28例Tiam 1蛋白表达阳性，阳性率为65.1%。28例女性肺癌中15例表达阳性，阳性率为53.6%，2组差异无统计学意义(P>0.05)。年龄≥60岁的27例肺癌中有19例表达阳性，阳性率为70.3%，<60岁的44例肺癌中有24例表达阳性，阳性率为54.5%，两者差异无统计学意义(P>0.05)。71例肺癌中病理证实有淋巴结转移有28例，Tiam 1蛋白表达呈阳性的有21例，阴性7例，阳性率为75.0%;没有发生转移的有43例，Tiam 1蛋白表达呈阳性的有19例，阴性24例，阳性率为44.2%，2组差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

　　定量分析:在71例肺癌中，有脑转移的肺癌中Tiam 1蛋白的平均光密度值是与无脑转移的比较，差异有统计学意义(P<0.05)。有淋巴结转移的肺癌中Tiam 1蛋白AOD与无淋巴结转移比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。表1 Tiam 1在各项指标中阳性率比较表2 不同指标下Tiam 1蛋白的平均光密度值比较

　　3 讨论

　　Tiam 1基因除在人的大脑和睾丸组织中表达外，在其他正常组织中不表达或仅有低度表达。Tiam 1基因编码产物是一个分子量为177 KD、由1 591个氨基酸残基组成的蛋白质，属 　　图1 Tiam 1在肺鳞癌中的阳性表达(免疫组化×400)图2 Tiam 1在肺腺癌中的阳性表达(免疫组化×400)图3 Tiam 1在正常肺中的阳性表达(免疫组化×400)于Dbl(diffuse Bcell lymphoma oncogene family)家族成员。Tiam 1基因是二磷酸鸟嘌呤核苷酸(GDP)与三磷酸鸟嘌呤核苷酸(GTP)转换因子，现已证实该基因在多种肿瘤细胞系中均有表达，并与肿瘤的侵袭和转移能力密切相关。

　　Habets等[2]通过研究发现，在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、胰腺癌等恶性肿瘤中，Tiam 1蛋白的表达与肿瘤的分化程度密切相关。Adam等[6]采用蛋白免疫印迹研究发现，Tiam 1在乳腺癌瘤组织中呈过度表达，与肿瘤组织分级Ⅱ级者相比，Ⅲ级者有较高的Tiam 1表达水平，表明Tiam 1的表达与乳腺癌的恶性程度密切相关。赵文明等[7]通过对Tiam1在胃癌细胞中的表达水平研究发现，胃癌组织中有淋巴结转移者Tiam1蛋白高表达率明显高于无淋巴结转移者，用生存分析的方法发现随着Tiam1蛋白表达的增高患者预后不佳，高表达率在一定程度上反映了胃癌的局部浸润和远处转移，提示Tiam1基因可以为胃癌与非癌的鉴别提供参考。杜江等[8]用免疫组化检测NSCLC的Tiam1，实验结果显示Tiam1与性别、年龄、分化程度无明显相关性;有淋巴结转移者的Tiam1阳性表达率显著高于无淋巴结转移者，Ⅲ+Ⅳ期的Tiam1阳性表达率显著高于Ⅰ+Ⅱ期的表达水平，说明Tiam1阳性表达的NSCLC容易发生淋巴结转移，并且Tiam1表达更多见于NSCLC的晚期患者。

　　本研究71例NSCLC患者中，有周围淋巴结转移者36例，存在颅内转移者18例。免疫组化法显示，无论在Tiam 1的表达阳性率或表达量上，有转移的肿瘤组织明显高于无转移者，两者差别显著(P<0.05)。上述结果说明Tiam 1的过量表达与NSCLC的周围淋巴结转移和颅内转移有关，所以我们可将Tiam 1的表达作为判断NSCLC转移能力的一个实验室指标，对预测NSCLC淋巴结转移、颅内转移的发生具有重要意义。 结合文献资料[9-13]，我们认为Tiam1在NSCL转移中的作用主要在于：Tiam1参与调节肿瘤细胞黏附分子，它作用于肿瘤细胞外基质，能定位于成神经细胞瘤细胞的生长端胞膜内侧，与生长端形体重塑和神经突形成有关，当成神经瘤细胞与基质成分层粘连蛋白黏附后，通过Tiam1Rac1信号途径调节瘤细胞形体的延展与神经突形成，促进其运动和侵袭。Tiam1在NSCLC的研究中结果提示，测定NSCLC中Tiam1的表达有助于评估NSCLC的临床进展、淋巴结转移潜能，根据Tiam1在恶性肿瘤中的表达和其诱导肿瘤机制分析，推测Tiam1可能与NSCLC并脑转移关系密切。相信对Tiam1的进一步研究和新技术的应用有助于进一步揭示肿瘤机理，Tiam1有望成为肿瘤的诊断和基因治疗新的靶点，有可能作为肿瘤预后估计的标记物。

　　【参考文献】

　　1 王耀锋.化疗联合热疗治疗非小细胞肺癌临床观察.中国基层医药，2008，15：1636.

　　2 Habets GG,Scholtes EH,Zuydgeest D,et al.Indentification of an invasioninducing gene,Tiam1,that encodes a protein with homology to GDPGTP exchangers for Rholike proteins.Cell,1994，77:537549.

　　3 Engers R,Zwaka TP,Gohr L,et al.Tiam1 mutations in humanrenalcell carcinomas.Int J Cancer,2000,88:369376.

　　4Bourguignon LY,Zhu H,Shao L,et al.AnkyrinTiam1 interaction promotes Rac1 signaling and metastatic breast tumor cell invasion and migration.J Cell Biol,2000,150:177191.

　　5Minard ME,Herynk MH,Collard JG,et al.The guanine nucleotide exchange factor Tiam1 increases colon carcinoma growth metastatic sites in an orthotopic nude mouse model.Oncogene,2005，24:25682573.

　　6 Adam L,Vadlamudi RK,McCrea P,et al.Tiam1 overexpression potentiates heregulin induced lymphoid enhancer factor1/betacatenin nuclear signaling in breast cancer cells by modulating the intercellular stability.J Biol Chem,2001,276:2844328450.

　　7 赵文明,耿敬姝.Tiam1基因在胃癌中的表达及意义.实用肿瘤学杂志,2007,87:912.

　　8 杜江,张林.非小细胞肺癌中Tiam1的表达及其临床病理意义.中国医科大学学报,2005,4:329331.

　　9 李红方，郝玉增，赵惠民，等.Tiaml、VEGF在非小细胞肺癌中的表达及与微血管生成的关系.河北医药，2009，31：134136.

　　10 Matsuo N,Terao M,Nabeshima Y,et al.Roles of STEF/Tiam1,guaninucleotide exchange factors for Racl，in regulation of growth come mophology.Mol Cell Neurosci,2003,24:6981.

　　11 Otsuki Y,Tanaka M,Kamo T,et al.Guanine nucleotide exchange factor Tiam1,directly binds to cMyc and interferes with cMycmediated apoptosis in rat1 fibroblasts.J Biol Chem,2003,278:51325140.

　　12 Simon AR,Vikis HG,Stewart S,et al.Regulation of STAT3 by direct binding to the Rac1 GTPase.Science,2000,290:144147.

　　13 Malliri A,vander Kammen RA,Clark K,et al.Mice deficient in the Rac activator Tiam1 are resistant to Rasinduced ski tumours.Nature,2002,417:867871.