HBeAg阳性和阴性慢性乙型肝炎病毒学病理学及免疫组化对照研究

　　【摘要】 目的 探讨HBeAg阳性(e+CHB)与HBeAg阴性慢性乙型肝炎(e-CHB)病毒学、病理学及肝组织免疫组化的特征、差异及其内在规律。方法 按照纳入标准选择e+CHB患者107例;e-CHB患者102例。检测生化学;乙肝五项;HBV DNA定量;肝组织HE染色，MASSON染色及网状纤维染色，进行病理诊断;Knodell HAI评分，纤维化评分;肝组织免疫组化半定量法检测HBsAg、HBcAg。结果 临床诊断与病理诊断符合率 e+CHB组62.6%，e-CHB组72.5%;e-CHB组纤维化程度较e+CHB组重，纤维化评分较高(P<0.01)。e+CHB组HBVDNA载量明显高于e-CHB组，有统计学差异(t=5.38，P=0.000)。e-CHB组HBV DNA载量和G分级、评分间有相关性(Pearson相关系数：0.24，P=0.041);肝组织HBcAg表达强度与血清HBV DNA定量间正相关(P<0.01)。结论 e-CHB患者肝组织病理损害较重;e+CHB和 e-CHB患者绝大部分存在病理损害。提倡适时进行肝穿刺活检,准确诊断和及时抗病毒治疗。

　　【关键词】 乙型肝炎病毒; HBeAg阴性慢性乙肝; HBeAg阳性慢性乙肝; 肝组织病理学;免疫组织化学

　　【Abstract】 Objective To investigate the relationship between HBeAg and liver function,HBV virology,liver/immunohistochemistry and histopathology.Methods 107 patients with HBeAg positive chronic hepatitis(e+CHB)B and 102 patients with HBeAg negative chronic hepatitis B(e-CHB)were observed and compared,and HBVDNA,serum ALT,AST,total biliary,HbsAg,HbeAg were detected in the patients of both groups.All the patients received liver biopsy,and the patients’ histological inflammation grade (G),fibrosis stage (S) were detected by immunohistochemistry.Results The clinical diagnosis of 62.6% e+CHB patients and 72.5% e-CHB patients were confirmed by liver histopathology.The liver fibrosis of e-CHB patients was more severe than that of patients with e+CHB.The HBVDNA levels of e+ CHB patients were significantly higher than those of e-CHB patients (P<0.01).There was no significant difference in liver histopathological changes between e-CHB patients and e+ CHB patients.There was a correlation between histological inflammation grade and HBV DNA in e-CHB patients (P<0.05).There was a positive correlation between HBcAg in liver tissues and the serum levels of HBV DNA(P<0.01).Conclusion There exists pathological injury in most e+CHB patients and e-CHB patients.So,liver biopsy is recommended and necessary in CHB patients for accurate diagnosis and antiHBV therapy.

　　【Key words】 HBV;HBeAg negative CHB;HBeAg positive CHB;liver/histopathology;immunohistochemistry

　　慢性乙型肝炎分为HBeAg阳性(e+CHB)和HBeAg阴性(e-CHB)两种[1]。近年来的临床与基础研究表明,两者各有其特征[2，3]。我们从2006年始通过回顾性与前瞻性相结合的方法，对e+CHB和e-CHB的特征、规律及临床意义进行大样本对照研究。揭示e+CHB和e-CHB在病毒学、病理组织学、免疫组化等方面的特征及差异，分析相关因素,探讨临床特点及变化规律，为临床医生判断两类患者病情，指导用药，预测预后等方面提供科学的理论依据。现将研究结果报告如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　我院2006至2008年符合纳入标准的研究对象共209例，e+CHB患者107例;e-CHB患者102例。e+CHB患者：男90例，女17例;平均年龄(33±12)岁;临床诊断轻度65例，中度32例，重度10例。e-CHB患者：男89例，女13例;年龄(35±11)岁;临床诊断轻度40例，中度44例，重度18例。2组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。

　　1.2 入选标准

　　所有患者均排除甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎重叠感染，排除酒精性肝病、脂肪肝、自身免疫性肝病和药物性肝炎等其他肝病。排除肝癌、黄疸较深、明显腹水、明显出血倾向、多脏器功能衰竭及所有不适合肝穿活检者。

　　1.2.1 HBeAg(+)慢性乙型肝炎入选标准：血清HBsAg、HBeAg阳性，抗HBe阴性，HBVDNA阳性，血清ALT持续或反复升高，或肝组织学检查有肝炎病变。

　　1.2.2 HBeAg(-)慢性乙型肝炎入选标准：血清HBsAg和HBV DNA阳性，HBeAg持续阴性，抗HBe阳性或阴性，血清ALT持续或反复异常，或肝组织学检查有肝炎病变。

　　1.3 研究方法

　　1.3.1 病毒学检测：血清HBV DNA检测采用荧光定量PCR技术,试剂盒由广州中山达安基因有限公司提供，阴性参考值为<1×103拷贝/ml。

　　1.3.2 乙肝病毒标志物检测：血清HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe和抗HBc采用酶联免疫吸附法检测，试剂盒由上海科华生物工程股份有限公司提供。

　　1.3.3 肝功能检测：血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(TBiL)、白蛋白(ALB)用全自动生化分析仪OLYMPUS AU 400,试剂由北京九强生物技术有限公司提供 。

　　1.3.4 肝脏活体组织穿刺病理检查：彩超引导下用16G穿刺针，采用弹射式组织活检枪一秒钟穿刺法，取肝组织长度在1.0～1.5cm之间，取材后立即10%甲醛固定、常规脱水、浸蜡包埋，进行厚度为4 μm连续切片。依次进行HE常规染色，MASSON三色染色及网状纤维染色。由CMIAS系列多功能真彩色病理图像分析系列读片,在镜下至少包括6个汇管区。炎症和纤维化分期标准参照2000年病毒性肝炎防治方案[4]。同时进行Knodell HAI和纤维化评分。对肝组织进行免疫组化标记，试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。免疫组化步骤采用SP法，操作步骤按说明书。肝组织中HBsAg、HBcAg表达的评价用半定量计分法,无明显阳性细胞为(-),阳性细胞<25%为(+),25%～49%为(++),≥50%为(+++)。并设阴性对照(用PBS缓冲液代替一抗)。

　　1.4 统计学分析

　　应用SPSS 13.0 统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 e+CHB组与e-CHB组患者临床诊断与病理诊断

　　临床诊断与病理诊断符合率:e+CHB组62.6%，e-CHB组72.5%;e+CHB组与e-CHB组病理检测结果见表1。e-CHB组临床诊断与病理损害均较e+CHB组为重。e-CHB组纤维化程度比e+CHB组为重，纤维化评分较高，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。表1 e+CHB组与e-CHB组病理检测结果表例表2 e+CHB组与e-CHB组临床诊断与病理结果分析表

　　2.2 e+CHB组与e-CHB组患者病毒学检测结果

　　e+CHB和e-CHB患者HBVDNA载量检测结果分别是：(5.9±1.4) log10copies/ml、(4.3±2.2)log10copies/ml，e+CHB组明显高于e-CHB组(t=5.38，P<0.01)。 e+CHB组HBVDNA载量和G、S分级、评分间无相关性(P>0.05);e-CHB组HBV DNA载量和G分级、评分间有相关性(Pearson相关系数：0.24，P=0.041)和S分级、评分间无相关性(P>0.05)。

　　2.3 e+CHB组与e-CHB组患者肝组织HBsAg、HBcAg检测结果

　　e+CHB组检测72例;e-CHB组53例，共计125例。另84例由于不符合检测标准剔除。e+CHB组肝组织中HBsAg阳性63例(87.5%)，HBcAg阳性42例(58.3%);e-CHB组肝组织中HBsAg阳性41例(77.4%)，HBcAg阳性23例(43.4%)。临床诊断重、病理炎症分级重者HBcAg阳性表达减少，e+CHB组与e-CHB组HBcAg阳性率比较差异无统计学意义(χ2=2.73，P=0.09);但是临床诊断为轻度和重度的HBcAg阳性率比较差异有统计学意义(χ2=5.10，P=0.024);肝组织HBsAg的表达强度与肝组织炎症程度及纤维化程度均无相关性 (r分别为0.041和0.006,P>0.05)。而肝组织中HBcAg的表达强度与肝组织炎症程度及纤维化程度呈负相关(r分别为-0.26和-0.25,P<0.05)。肝组织HBsAg表达强度与血清HBV DNA定量间无相关性，肝组织HBcAg表达强度与血清HBV DNA定量间呈正相关(r=0.41,P<0.01)。见表3。表3 e+CHB组与e-CHB组免疫组化检测结果表例

　　3 讨论

　　慢性乙型肝炎患者出现HBeAg血清学转换、HBV DNA水平下降及肝功能改善后,一般认为病情趋于稳定;但部分患者HBeAg血清学转换后,HBVDNA水平仍较高,肝组织炎症仍继续进展,成为HBeAg(-) CHB。e-CHB系由不能产生HBeAg的HBV病毒株引起，主要由HBV前C区或核心区启动子变异，是HBeAg阴性CHB发生的主要机制。常见的变异包括前C区第1 896位核苷酸G被A替换而出现终止密码子TAG，导致蛋白翻译停止，HBeAg不能合成.HBV核心区启动子区域(BCP)在1 762位和1764位的AT和GA突变，影响前C区mRNA转录，减少HBeAg合成而表现为HBeAg阴性[5-7]。本文结果显示e-CHB组ALT水平低于e+CHB组,而无论临床诊断还是病理损害e-CHB组均较e+CHB组为重;e-CHB组患者血清HBV DNA水平与肝脏炎症分级和HAI评分有显著性相关。可能是由于e-CHB组患者肝组织炎症损害的累积程度较严重,可破坏的健康肝细胞相对不足，血清HBV的高复制更容易启动和激发机体的免疫反应，造成肝组织损伤加重有关。

　　本研究结果显示，e+CHB组HBV DNA载量明显高于e-CHB组，e+CHB组HBV DNA复制水平较高，具统计学意义(P=0.000),与文献报道相一致[8，9]。证实了血清e抗原与血清HBVDNA定量有良好的一致性[10];也与肝组织内HBcAg表达有一致性。本组肝组织HBcAg阳性者血清HBVDNA均值较阴性者高。肝组织HBcAg的表达强度与肝组织炎症程度及纤维化程度呈负向的关联性,提示 HBcAg是诱发细胞免疫反应的靶抗原,表达HBcAg的肝细胞被破坏时,肝脏出现炎症,肝组织损害加重，HBcAg表达强度反而下降。提示对于肝组织损害较重者，肝组织HBcAg检测不是一个敏感指标。

　　本组资料显示,ALT中、重度升高者大部分具备抗病毒治疗指征,ALT正常和轻度异常者亦有相当部分应抗病毒治疗。对慢性HBV感染者,尤其是年龄较大、ALT轻度异常者,更应争取进行肝活检,及时、准确了解肝组织病变。

　　【参考文献】

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