WWOX 及P53基因在大肠癌中的表达及与肿瘤浸润的关系

　　【摘要】 目的 探讨WWOX(WW domaincontaining oxidoreductase)基因及P53在大肠癌组织中的表达情况、相关性及与肿瘤浸润转移的关系。方法 用免疫组化染色的方法分别检测WWOX 及P53基因在35例大肠癌组织及14例正常大肠粘膜组织中的表达情况。结果 WWOX基因在大肠癌组织中的表达明显降低，与正常组织比较差异有统计学意义(P<0.05)。P53(突变型)基因在大肠癌组织中的表达明显高于正常组织，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。WWOX与肿瘤浸润、淋巴结转移情况密切相关(P<0.05)。P53表达与癌组织的浸润密切相关(P<0.05)，与淋巴结转移情况无关(P>0.05)。WWOX与P53基因的表达情况均与患者的年龄、性别无关(P>0.05)。WWOX与P53基因的表达呈负相关(r=-0.442,P=0.008)。结论 WWOX、P53(野生型)基因同为抑癌基因，且两者之间在大肠癌的发生、浸润及转移过程中有着较为明显的协同作用，联合评价其功能具有重要的临床意义。

　　【关键词】 大肠癌,基因表达,WWOX,P53

　　【Abstract】 Objective To investigate the relationship between the expression of tumorassociated gene WWOX (WW domaincontaining oxidoreductase) and P53 in large intestine carcinoma tissue and their relationship with tumor infiltration.Methods Immunohistochemical staining method was to detect the expression of WWOX and P53 gene in 35 cases of large intestine carcinoma tissues and 14 cases of normal colonic tissues respectively.Results There was a significant difference in the expression of WWOX between large intestine carcinoma tissues and normal tissue (P<0.05).The expression of WWOX was closely related with tumor invasion depth and lymph node metastases(P<0.05).The expression of P53 (mutant) in large intestine carcinoma tissues was significantly higher than that in normal tissues,there was a significant difference between the two kinds of tissues(P<0.05).The expression of P53 was closely related with tumor invasion depth(P<0.05).The expression of P53 (mutant) in large intestine carcinoma tissues was not obviously related with lymph node metastasis (P>0.05).The expression of the two kinds of genes had no obvious correlation with the patient’s age and gender(P>0.05).The expression of WWOX was negatively related to that of P53(mutant) in large intestine carcinoma tissues (P<0.01).Conclusion The WWOX and P53 (wild type) genes are all tumor suppressor genes,and the two genes have obvious synergistic action in the pathogenesis,invasion and transfer process of large intestine carcinoma.Therefore,the combined evaluation for the two genes’ function has important clinical significance.

　　【Key words】 colonic carcinoma; gene expression; WWOX;P53

　　大肠癌是常见的恶性肿瘤之一，在我国发病率逐年递增，成为影响国民健康的又一因素，但其确切病因尚未定论，目前研究表明WWOX为抑癌基因，其抑制肿瘤生长、转移和诱导肿瘤细胞凋亡的过程与P53基因相关。两种基因在大肠癌组织中表达的相关性与大肠癌发生、浸润转移等生物学行为关系的研究笔者未见报道。对两种抑癌基因的研究也许为大肠癌的治疗提供理论上的依据或新的思路。本实验采用免疫组化(SP)法，同时检测大肠癌及正常大肠黏膜组织石蜡标本切片中WWOX及P53基因的表达，观察这两种基因在大肠癌组织中的表达情况及其表达的相关性，并就其与肿瘤浸润及转移等临床意义进行分析。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　收集2007 年1 月至2008 年6 月河北医科大学第二医院外科手术切除并经病理组织学证实的大肠癌标本35例,男19 例，女16例;平均年龄58岁。14例正常标本取自外伤及结肠良性疾病患者，并经病理证实。入选病例皆未进行化疗或放疗。

　　1.2 试剂

　　WWOX兔抗人多克隆抗体购自英国Abcam公司,稀释浓度为1∶200;P53鼠抗人单克隆抗体同样购自美国Santa cruz公司，稀释浓度为1∶100。免疫组化染色SP试剂盒及DAB显色试剂盒购于北京中杉公司。

　　1.3 方法

　　标本用10%甲醛固定,石蜡包埋,4 μm连续切片。采用免疫组织化学SP法,按试剂盒使用说明书进行。切片常规脱蜡入水,3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶,微波抗原修复,5%羊血清处理20 min,滴加一抗4℃过夜,DAB显色,苏木素复染;PBS代替一抗作阴性对照。

　　1.4 结果判定

　　WWOX蛋白染色以腺体胞浆内出现黄至棕褐色颗粒为阳性;采用半定量积分法判断结果,即每张切片观察10个高倍视野,每个高倍视野记数100个细胞(不足10个高倍视野的记数全部视野)，按照阳性细胞所占百分比与着色深浅进行打分:(1)根据阳性细胞所占百分比评分:阳性细胞数≤5%为0分,6%～25%为1分,26%～50%为2分,51%以上为3分。(2)根据着色强度进行评分:无显色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。取(1)(2)项评分的乘积作为染色结果的评判标准:0分为阴性(-),1～2分为弱阳性(±),3～6分为阳性(+),7～9分为强阳性(++)表达,≥3分统计为阳性。P53蛋白阳性定位于细胞核,为黄至棕褐色颗粒。且其着色强度高于背景非特异性染色者判定为阳性。判断结果参照1996年全国免疫组织化学技术与诊断标准化专题研讨会意见，以连续观察10个高倍视野(10×40)，免疫反应阳性细胞数超过25%作为组织阳性诊断标准。免疫反应阳性细胞数占总细胞数小于25%为(-)，25%～50%为(+)， 50%以上为(++) 。

　　1.5 统计学分析

　　应用SPSS 13.0统计软件，计数资料采用χ2 检验,采用Spearman秩相关分析各指标表达的相关性,P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 WWOX在大肠癌组织及对照组中的表达

　　无论大肠癌组织还是对照组，WWOX蛋白的阳性颗粒均主要分布于腺体的胞浆。35例大肠癌组织中WWOX蛋白表达阳性13例(37.1%)，对照组表达阳性 10例(64.3%)，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

　　2.2 P53蛋白在大肠癌组织及对照组中的表达

　　P53蛋白的阳性颗粒均主要分布于腺体的胞核。大肠癌组织中P53蛋白表达阳性29例(77.1%)，对照组表达阳性1例(7.1%)。2组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

　　2.3 大肠癌组织中WWOX与P53(突变型)表达的相关性

　　本实验表明WWOX与P53(突变型)在大肠癌组织中的表达呈负相关(r=-0.442,P=0.008)。见表1。表1 Spearman 秩相关分析wwox与P53(突变型)表达的相关性

　　2.4 WWOX、P53与临床参数之间的关系

　　WWOX基因在大肠癌组织中的表达水平与性别、年龄无关(P>0.05)，与肿瘤浸润及淋巴结转移密切有关(P<0.05)， P53基因与性别、年龄、淋巴结转移都无关(P>0.05)，而与肿瘤浸润有关(P<0.05)。见表2。表2 WWOX和P53在大肠癌组织中的表达及与肿瘤浸润、转移的关系

　　3 讨论

　　肿瘤的发生、浸润和转移是个相当复杂的病理生理过程,其中涉及到多种癌基因的激活与抑癌基因的突变和或失活。研究表明，大肠癌的发生、浸润和转移是多基因变异所致的结果。多种肿瘤相关基因的异常表达均可导致大肠癌的发生、浸润和转移。其中抑癌基因失活和或变异在大肠癌发展过程中起了很重要的作用。含有WW结构域的氧化还原酶基因(WWOX)是2000年Bednarek等[1]分离出的一种抑癌基因。该基因位于染色体FRA16D脆性位点上,在环境致癌物等作用下易失活。WWOX蛋白含有414个氨基酸,是一种促凋亡蛋白,参与多种信号转导途径[2-4]:增强TNF介导的细胞毒性,与TNF凋亡途径中的TRADD和TRAF2作用;与IκBα/P53凋亡途径中的P53 作用等。Chang等[3]研究指出WWOX蛋白主要位于线粒体,在凋亡应激因素TNF、十字胞碱、苍术苷等作用下,WWOX蛋白合成增加,第一个WW结构域中的Try33磷酸化,线粒体通透性改变,WWOX蛋白从线粒体转位至细胞核,上调促凋亡因子P53,下调抗凋亡因子Bcl2、BclXl,从而增强TNF介导的细胞毒性;同时增强TRADD介导的细胞死亡。WWOX基因与P53同为促凋亡蛋白，在介导凋亡中发挥协同作用，且WWOX基因是P53介导凋亡必不可少的配偶体。WWOX在多种消化道肿瘤如食管癌、胃癌[5]、肝癌等组织中表达降低或缺失。

　　研究发现P53基因在控制细胞周期和细胞凋亡过程中发挥重要作用。P53基因有两种类型：野生型和突变型。野生型P53基因与调控细胞生长周期、调节细胞转化、DNA复制、诱导细胞程序性死亡有密切关系。P53参与细胞周期调控，阻止细胞从G1期进入S期，对细胞分裂与增殖起负调控作用，是肿瘤抑制基因。突变的P53蛋白不能引起细胞增殖的停滞或凋亡，导致细胞生长失控，肿瘤发生。P53基因突变是人类肿瘤中最常见的基因异常，也是研究比较多的基因。人类许多肿瘤中均有不同程度的P53基因突变，在乳腺癌、肺癌、大肠癌[6]、胃癌等肿瘤中突变型P53通常高水平表达。

　　本次研究发现，WWOX在大肠癌组织中的表达明显降低，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。P53(突变型)基因在大肠癌组织中的表达明显高于对照组，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。WWOX与大肠癌浸润程度、淋巴结转移情况密切相关(P<0.05)，表明在大肠癌的浸润转移中起着重要作用。P53(突变型)表达与肿瘤浸润密切相关，与癌组织的淋巴结转移情况无关，表明P53基因突变可能参与大肠癌的发生、发展过程。上述结果表明，WWOX、P53(野生型)基因同为抑癌基因，其正常生物学活性的发挥对大肠癌的发生、浸润及转移都起着明显的抑制作用。故WWOX、P53基因失活或突变都可能成为影响大肠癌发生、浸润及转移的重要因素。很多研究表明WWOX发挥其正常的生物学行为、抑制肿瘤过程中均与P53基因相关，P53基因对WWOX在大肠癌发生转移过程中起着调控和或协同作用，故本实验选择将两者并列研究，以明确两者之间的相关性。结果显示： WWOX与P53(突变型)基因的表达呈负相关。这说明正常P53(野生型)基因的突变与WWOX基因的表达降低或失活在大肠癌的发生、浸润和转移中起着协同作用。

　　通过本次研究我们发现，同时作为抑癌基因，WWOX表达降低或缺失与P53基因的突变在大肠癌的发生、浸润和转移过程中起着协同或调控作用，并且这种作用可能加速了大肠癌的发生、浸润和转移。故检测二种基因在大肠癌组织中的表达情况对其诊断治疗、淋巴结转移情况的判断有很大的帮助，但以上二种基因之间相互作用的具体机制尚无定论，生物学作用及其与肿瘤之间的相互关系有待于广大学者的进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 Bednarek AK,Laflin KJ,Daniel RL ,et al.WWOX,a novel WW domain  containing protein mapping to human chromosome16q23.324.1,a region frequently affected in breast cancer .Cancer Res,2000,60:21402145.

　　2 Chang NS,Doherty J,EnsignA,et al.Molecular mechanisms underlyingWOX1 activation during apoptotic and stress responses.Biochem Pharmacol ,2003,66:13471354.

　　3 Chang NS,Pratt N,Heath J,et al.Hyaluronidase induction of a WW domaincontaining oxidoreductase that enhances tumor necrosis factor cytotoxicity.J Biol Chem,2001,276:33613370.

　　4 Chang NS,Doherty J,Ensign A.cJun Nterminal kinase 1 (JNK1) physically interacts with WW domaincontaining oxidoreductase (WOX1) and inhibits WOX1mediated apoptosis.J Biol Chem,2003,278:91959202.

　　5 Aqeilan RI,Kuroki T,Pekarsky,et al.Loss of WWOX expression in gastric carcinoma J.Clinical Cancer Res,2004,10:30533058.

　　6 陈卫昌，林茂松，张宝峰，等 结肠癌组织中P53和凋亡相关基因bcl2、bax的表达及其临床意义.胃肠病学，2006,11:395399.