灵芝菌丝体多糖对K562细胞的抑制作用及免疫调节作用研究

　　【摘要】 目的 研究灵芝菌丝体多糖(ganoderma lucidum mycelia polysaccharides， GLMP)对K562白血病细胞及小鼠体外脾淋巴细胞增殖的影响。方法 MTT法检测不同浓度GLMP对K562白血病细胞增殖及对小鼠体外脾淋巴细胞增殖的作用;血细胞计数方法绘制生长曲线。结果 不同浓度的GLMP处理K562细胞48 h后，50 mg/L及以上浓度抑制率与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，而且随浓度的增加抑制率增加。作用48 h的IC50为270.2 mg/L。生长曲线也表明随时间的延长和浓度的增加，细胞增殖能力下降。GLMP作用小鼠体外脾淋巴细胞48 h后，在多糖浓度为50、100 mg/L和25、50、100 mg/L时能显著刺激静止性和激活型细胞的增殖。结论 GLMP可以抑制K562白血病细胞增殖而且具有免疫调节能力。

　　【关键词】 灵芝菌丝体,多糖,白血病,脾淋巴细胞

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of Ganoderma lucidum mycelia polysaccharides (GLMP) on K562 leukemia cell and mouse spleen lymphocyte in vitro.Methods MTT assay was used to determine the effect of GLMP on the proliferation of K562 leukemia cell and spleen lymphocyte of mice. The cells number was counted by blood corpuscle counting every day,and the cell growth curve was made according to cell number.Results After K562 cells were treated with different concentrations of GLMP for 48h, the inhibition rates at 50 mg/L and >50mg/L groups were significantly increased,as compared with those of control group (P<0.01),furthermore,which was concentrationdependent.The IC50 after treated for 48h was 270.2mg/L.The cell growth curve showed that the cell proliferation ability was also decreased with the time and concentration.After spleen lymphocyte of nice in vitro was treated with GLMP for 48h the GLMP at 50,100mg/L and 25,50,100mg/L could obviously stimulate the proliferation of the cells at stable and active state . Conclusion GLMP can inhibit the proliferation of K562 leukemia cell and is able to regulate immunological function.

　　【Key words】 Ganoderma lucidum mycelia; polysaccharide;leukemia; spleen lymphocyte

　　灵芝隶属于担子菌纲，多孔菌目，灵芝科，灵芝属，是我国传统的真菌药物。灵芝多糖是从灵芝的子实体或菌丝体中提取的活性多糖，具有抗辐射，延缓衰老，抗氧化作用，能改善微循环、增加耐低氧能力，具有显著的降血糖功效[1-4]。体内外实验研究证实，灵芝多糖具有免疫调节作用和抗肿瘤作用[5]。从菌丝体中提取多糖，可以通过菌丝体发酵方法，简单易行，经济效益高。但目前对GLMP的研究很少，因此本研究拟从灵芝的菌丝体中提取的粗多糖为材料，研究其对人白血病细胞株K562增殖的影响及对小鼠脾淋巴细胞的转化作用。以期为GLMP的开发利用提供理论基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　GLMP由河北师范大学生命科学学院生化与分子生物学实验室赠送; K562白血病细胞系株引自中国医学科学院血液病研究所;BALB/c小鼠由河北医科大学动物中心提供。

　　1.2 细胞培养

　　K562细胞采用含有10%新生牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 mg/L的RPMI 1640培养基。置于37 ℃，5%CO2，饱和湿度环境下培养，待长满瓶底80%～90%后传代1次。

　　1.3 MTT检测抑制率

　　取对数生长期的细胞，以1×108/L细胞浓度接种于96孔培养板中，每孔加入100 μl。24 h后加入100 μl用无血清的RPMI1640培养基稀释的多糖，终浓度为25、50、100、200、400 mg/L，对照组加等量的无血清培养基。每种药物浓度均做8个复孔。在培养48 h后，每孔加MTT 20 μl，继续培养4 h，2 000 r /min离心10 min，弃去上清，每孔加二甲基亚枫150 μl，震荡10 min，用酶标仪测490 nm的A值。根据下列公式计算抑制率：抑制率=(对照组A-实验组A)/对照组A)×100%，并根据以上结果用82798 IC50软件计算出多糖作用的半数抑制浓度(IC50)。

　　1.4 生长曲线的绘制

　　取对数生长期的细胞，以8×104/ml细胞浓度接种于24孔培养板中，每孔加入1 ml。24 h后加入1 ml用无血清的RPMI1640培养基稀释的多糖，终浓度为50，100、200、400 mg/L,每种药物浓度均做4个平行孔。对照组加等量的无血清培养基。在培养至24、48、72、96、120 h后，用血细胞计数器计算每毫升溶液中细胞的数目，绘制生长曲线。

　　1.5 脾淋巴细胞制备

　　颈椎脱臼法处死小鼠，无菌切取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，Hanks液洗涤2 次，RPMI1640培养液调整细胞浓度至6×109/L，脾淋巴细胞悬液用于下列实验。

　　1.6 多糖对脾淋巴细胞转化的影响

　　96孔培养板中每孔加入100 μl脾细胞悬液，再加入100 μl不同浓度的多糖样品。每一样品均设有加ConA(终浓度为5 mg/L)的实验组与不加ConA对照组，同时设不加样品的阴性对照组。每组设8孔重复，置37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养48 h。培养结束前4 h，每孔加入20 μl MTT(2 g/L)，继续培养4 h。每孔加入DMSO 150 μl裂解细胞后，用酶联免疫检测仪于490 nm下测定A值，计算刺激指数，SI=实验组A/对照组A。

　　1.7 统计学分析

　　应用SAS 6.12统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 GLMP对K562细胞增殖的作用

　　GLMP 作用K562细胞48 h后，在50 mg/L及以上浓度组与对照组比较抑制作用差异有统计学意义(P<0.01)，抑制率随多糖浓度的升高而增大。通过MTT实验结果测得在作用48 h A值，计算出GLMP对K562细胞抑制作用的半数抑制浓度(IC50)是270.2 mg/L。见表1。表1 GLMP对K562细胞增殖的抑制作用

　　2.2 GLMP对细胞生长的影响

　　与对照组相比，GLMP处理组在每个浓度组，细胞生长都明显被抑制，而且随浓度的增大，抑制作用增强，随时间延长，抑制作用增加，浓度为400 mg/L作用48 h后的细胞，活细胞数目下降，细胞死亡数目逐渐增加。见图1。

　　2.3 GLMP对静止型脾淋巴细胞作用

　　GLMP对静止型脾淋巴细胞刺激作用，与对照组相比，在GLMP浓度为50和100 mg/L作用时，刺激指数明显高于对照组，当浓度过高或过低时差异消失;各浓度处理组对静止型脾淋巴细胞都有刺激作用(刺激指数>1)。见表2。图1 GLMP对K562细胞生长的影响 表2 GLMP静止型脾淋巴细胞的刺激作用

　　2.4 GLMP对激活脾淋巴细胞的作用

　　GLMP对ConA 激活的脾细胞转化刺激指数的作用，当GLMP浓度在25 mg/L、50 mg/L和100 mg/L作用时，明显高于对照组(P<0.01)，当浓度过高差异消失;各浓度处理组对激活型脾淋巴细胞都有刺激作用(刺激指数>1)。见表3。表3 GLMP激活型脾淋巴细胞的刺激作用

　　3 讨论

　　多年研究发现多种真菌多糖低毒而且是免疫活性强的抗肿瘤物质[6]。胡映辉等[7]研究发现，GLMP可以通过作用于脾淋巴细胞上清液间接诱导HL60的凋亡。本研究中用不同浓度的GLMP作用于人白血病细胞株K562细胞48 h后，发现当GLMP浓度大于50 mg/L时能显著抑制人白血病细胞株K562细胞的增殖，同时生长曲线也表明随多糖浓度增加和时间的延长抑制作用明显增强。而且在体外作用时能促进静止型和ConA激活型小鼠脾淋巴细胞的增殖。说明GLMP能和子实体多糖一样发挥抗肿瘤、提高免疫力的作用，因此可以考虑开发和利用。

　　【参考文献】

　　1 季修庆,吴士良,周迎会,等.灵芝多糖对γ射线照射后NIH3T3成纤维细胞细胞周期及细胞增殖的影响.苏州医学院学报,2001,21:279281.

　　2 游育红,林志彬.灵芝多糖对小鼠巨嗜细胞自由基的清除作用.中国临床药理学和治疗学,2004,9:5255.

　　3 邱玉芳,王新成,程玉昌,等.灵芝多糖口服液对小鼠微循环及耐缺氧能力的研究.泰山医学院学报,2003,24:345347.

　　4 张慧娜,林志彬.灵芝多糖对大鼠胰岛细胞分泌胰岛素功能的影响.中国临床药理学与治疗学,2003，8:263265.

　　5 Yi Zhen Xie,Sen Zhu Li,Albert Yee，et al.Ganoderma lucidum inhibits tumour cell proliferation and induces tumour cell death.Enzyme and Microbial Technology,2006,40:177185.

　　6 邱玉芳，邢东升，邓文.灵芝多糖口服液对小鼠免疫功能影响的研究.泰山医学院学报，2004，25:586588.

　　7 胡映辉，林志彬. 灵芝菌丝体多糖对HL60细胞凋亡的影响.药学学报， 1999，34:264268.