益气化痰组方对慢性支气管炎模型小鼠的药理学作用研究

　　【摘要】 目的 从药理学角度研究化痰组方对慢性支气管炎模型小鼠抗炎、化痰、平喘、镇咳及机体免疫力的影响，揭示中药作用机制。方法 采用烟熏和SO2交替法造模，共计3周。48只小鼠分为模型组、益气化痰方低、中、高剂量组。治疗2周后，观察小鼠咳嗽潜伏期和咳嗽频率的变化;采用爬杆试验观察各组动物运动能力;酚红排痰实验测定痰液的分泌情况。结果 造模3周后，与造模前相比，小鼠体重明显降低(P<0.05);小鼠咳嗽潜伏期明显缩短(P<0.05);咳嗽频数明显增加(P<0.05)。治疗2周后，中、高剂量组均能够有效延长小鼠咳嗽潜伏期时间和降低咳嗽频率(P<0.05)，但低剂量药物无明显影响(P>0.05)。中、高剂量组均能增加痰液分泌(P<0.01)，有明显祛痰作用。各治疗组均能明显延长小鼠爬杆时间(P<0.05)。结论 烟熏和SO2交替法烟熏可使小鼠成功患慢性支气管炎。高、中剂量益气化痰组方具有镇咳、平喘、化痰作用;但高、中、低剂量均具备强心、提高机体免疫力和抗疲劳等作用。

　　【关键词】 慢性支气管炎,益气化痰组方,酚红排痰,应激反应

　　【Abstract】 Objective To investigate on the pharmacological effect of Yiqihuatan prescription on mice with chronic bronchitis and its action mechanism.Methods The mice models with chronic bronchitis were induced by smudging and SO2 alternately for 3 weeks.Then the mice were randomly divided into control group, model group and low,middle and high dose groups .The changes at latent period and cough frequency after 2week treatment were observed.The climbing pole test was performed to observe the ability of moving after treated,and the secretion amount of phlegm in different groups was detected by phenol red expectoration test.Results The weight of mice was significantly decreased 3 weeks after the models were established,as compared with that before model establishment (P<0.05);the latency period of cough was obviously shortened (P<0.05); the frequency of cough was significantly increased (P<0.05). After 2week treatment,the middle and highdose drug groups could effectively prolong the latency period and frequency of cough (P<0.05),but the lowdose drug had no obvious effect on them (P>0.05).The middle and highdose drug groups could significantly increase the secretion amount of phlegm (P<0.01),and had obvious effect of expelling phlegm. All the groups could obviously prolong the time of climbing pole in the mice (P<0.05).Conclusion The smudging and SO2 alternately can induce chronic bronchitis in mice.The synergic effect of different drugs in Yiqihuatan prescription have antiinflammation,antitussive, eliminating sputum, improving the immune ability and antifatigue action.

　　【Key words】 chronic bronchitis;Yiqihuatan prescription;phenol red expectoration; stress response

　　慢性支气管炎辨证多为本虚标实，虚实夹杂，证型以气虚血瘀痰阻最为常见。本虚以气虚、气阴两虚、脾肾阳虚为主，标实则以痰、瘀、风、热为著。治疗要标本兼治，虚、痰、瘀等同调。中医中医治疗阻塞性肺气肿分型论治方很多。在治疗上以急性发作期与缓解期论治为纲，按证候表现特点分型论治。我们在常规方剂的基础上，进行改良和总结出来的“益气化痰”有效方剂，并从实验室的基础药理学角度，系统观察改良方剂对慢性支气管炎小鼠药理作用和机制，为进一步推广其临床运用提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　(1)实验动物：昆明级SD小鼠60只，雌雄不分，体重25～30 g，由华北煤炭医学院动物实验中心提供。(2)药物：益气化痰方由党参15 g，黄芪20 g，陈皮10 g，法半夏10 g，茯苓15 g，杏仁10 g，白芥子15 g，制南星6 g，甘草6 g组成，生药由河北省技术学院科研处提供，华北煤炭医学院基础医学部理学教研室协助煎煮成汤剂。

　　1.2 试剂与仪器

　　酚红溶液、NaOH溶液、浓硫酸、钠石灰、无水亚硫酸钠、凡士林、烟丝、锯末、721分光光度仪、灌胃器、250 ml磨口瓶、1 ml注射器、试管数个、剪刀、解剖器械数套、实验橱柜、电子天平、秒表、红头绳、胶带纸、硬纸板、薄膜纸、小铁笼等。

　　1.3 方法

　　1.3.1 分组：将上述48只小鼠随机分为4组，每组12只：慢性支气管炎组(模型组)、益气化痰方低剂量组、益气化痰方中剂量组、益气化痰方高剂量组。

　　1.3.2 模型制作与观察：①模型制作：动物造模方法为被动二氧化硫+烟叶交替烟熏法，共计21 d。每日上午SO2造模，参照文献[1]改进：把动物按组分别放人4 L密闭箱内，用无水亚硫酸钠和硫酸反应产生SO2，使4 L密闭箱内SO2初始浓度达到0.09 mg/ml，熏40 min结束，将小鼠放回饲养;每日下午烟熏法，参照文献[2]改进。取烟丝12 g，锯末12 g，混合点燃，连同小鼠放入密闭实验橱柜熏30 min，每次熏完烟将小鼠置于通风处。第1、10、21天称体重。第21天测定实验指标。②一般情况观察:造模及用药期间每日观察动物咳嗽、气喘，活动状况、毛发光泽度、食量、体重等。③咳嗽指征观察：任取一小鼠，记下编号，将其放入铁笼中，其余步骤同烟熏操作，记录小鼠潜伏期和2 min内该小鼠咳嗽的次数：即当恰好关门时开始，至该小鼠首次咳嗽时计时停止，这段时间即为小鼠潜伏期，也称潜伏时间。然后记下在未来2 min内该小鼠咳嗽的次数。

　　1.3.3 药物熬制与给药：①药物熬制：先将所需药材按配方称重配好，用温水泡60 min;再放入锅中，加入水(500 g，1000 ml水)打开电磁炉加热煮沸，煮沸后保温40 min(120℃)，后将煮好的液体过滤，将滤液放入瓶中。第2次加水煮药材(水没过药材1～2 cm)煮沸后保温40 min;滤过液体，放入瓶中。②给药:分别于造模成功后，进行灌胃，给予各给药组小鼠相应剂量：益气化痰方高、中、低剂量组予以0.04166 ml/10g灌胃给药(每毫升含药物依次0.3566 g、0.1783 g、0.0892 g，分别相当于人剂量的20、10、5倍)，单纯模型和空白模型组小鼠等给予0.9%氯化钠溶液。连续14 d后取材。

　　1.3.4 爬杆试验：取一直径约1 cm,长约25 cm的玻璃棒，手持于玻璃棒一端，使其竖直悬空于离桌面约10 cm处;取一小鼠，提其尾，将其头部向上姿态放于玻璃棒上端，开始计时;待其从玻璃棒还上滑落下来计时停止。记下所用时间，重复操作3次，取平均值。计算爬杆时间延长百分率=(用药组-模型组)/模型组。

　　1.3.5 酚红排痰实验：①酚红标准曲线制作：精密称取酚红50 mg,用1 mol/l的NaOH溶液溶解后，加0.9%氯化钠溶液至50 ml,然后逐级稀释成浓度为10.00、7.50、5.00、2.50、1.00、0.50 g/ml的酚红溶液，在546 nm处测定吸收度，以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标作标准曲线。②酚红排痰[1]:腹腔注射7.05 mmol/L酚红溶液0.5 ml，注射后0.5 h颈椎脱臼处死，分离气管，剪下环状软骨至气管分叉处的一段，放入盛有4 ml 0.9%氯化钠溶液，0.5 ml 1 mol/L NaOH溶液的小平皿中反复冲洗，将冲洗液注入一比色管中，用721分光光度计比(n=546 nm)，根据酚红的标准曲线计算出酚红排泄量。

　　1.4 统计学分析

　　应用SPSS 12.0统计软件,计量资料以±s表示，计数资料采用χ2检验，组间差异用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 一般情况

　　模型组小鼠活泼好动，强壮肥大，食欲好，皮毛光泽发亮，体重22～30 g。模型组小鼠可听见明显的咳嗽、鼻部潮湿，食少，体毛干枯无光泽，拱背蜷睡，少动，反应迟钝，食少，体重下降等表现。表1 小鼠造模成功后指征观察结果

　　2.2 益气化痰组方对慢性支气管炎模型小鼠的咳嗽变化结果

　　与模型组比较，中、高剂量药物均能够有效延长小鼠咳嗽潜伏期时间(P<0.05)，但低剂量药物对咳嗽潜伏期影响无统计学意义(P>0.05)。与模型组比，中、高剂量药物均能够有效降低咳嗽频率(P<0.05)，但低剂量药物对咳嗽频率影响无统计学意义(P>0.05)。见图1、2。图1 小鼠治疗2周后对咳嗽潜伏期的影响图2 小鼠治疗2周后对咳嗽潜频数的影响

　　2.3 益气化痰组方对慢性支气管炎模型小鼠排痰量的影响 与模型组比较，中、高剂量组均能增加痰液分泌(P<0.01)，但低剂量组对痰液分泌无明显影响(P>0.05)。 见表2。表2 小鼠治疗2周后对酚红排痰量的影响

　　2.4 益气化痰组方对小鼠抗疲劳能力影响的研究

　　爬杆时间延长百分率分别是：中剂量组(405%)>高剂量组(230%)>低剂量组(145%);与模型组比较，高、中、低剂量组有统计学意义(P<0.05)，其中，以中剂量组效果最好。见图4。图4 益气化痰方对小鼠爬杆时间的影响

　　3 讨论

　　3.1 从表1可以看出，烟熏和SO2交替烟熏法可使小鼠成功患上慢性支气管炎[2]，交替法造模机制：刺激性烟雾、有害气体如SO2对支气管黏膜造成损伤，造成支气管杯状细胞增生，黏膜分泌增加，为细菌侵入创造条件;烟雾又可刺激气道产生痉挛，增加气道阻力;吸入烟雾还使支气管上皮纤毛变短、不规则，造成纤毛清除功能下降,纤毛运动受到抑制，进一步恶化气管清洁净化能力，使支气管黏膜充血、水肿、黏液积聚;烟雾中含有焦油、尼古丁和镉等有害物质能损伤呼吸道黏膜，降低呼吸道黏膜局部抵抗力，使呼吸道及肺泡中吞噬细胞功能减弱，免疫力降低。这些均有利于细菌移植到支气管，引发慢性支气管炎。

　　3.2 从图1、2和表2说明同模型组小鼠相比，高、中剂量组小鼠的咳嗽潜伏期时间明显延长、咳嗽频率有效降低、痰液排除量明显增加，因此我们肯定益气化痰组方对慢性支气管炎小鼠具有平喘镇咳和祛痰功效;但相对剂量较大，具有计量依赖性。从药物作用的药理学角度研究其机制包括：益气化痰方中甘草次酸胆碱盐作用于中枢，抑制延脑咳嗽中枢以镇咳。另外，其中的苦杏仁所含苦杏仁苷在下消化道被肠道微生物酶分解或被杏仁本身所含苦杏仁酶分解,产生微量氢氰酸,对呼吸中枢呈抑制作用,能使呼吸运动趋于安静而有止咳、平喘的效果[3，4]。因此甘草与杏仁作用于中枢可以起到镇咳的效果。相关离体实验[5]证明陈皮中的有效成分柠檬烯有松弛气管平滑肌，促使支气管扩张，对抗气管痉挛性收缩功效，有效地减少气道阻力，以上药物协同对痰、咳、喘起到抑制作用，具有重大的临床意义。

　　3.2.1 该组方中的陈皮具有良好抗菌作用，相关离体实验证实：陈皮可减轻慢性支气管炎的相关症状[5]。组方剂中的甘草和杏仁具有相协同的平喘镇咳作用;甘草能覆盖在发炎的咽部黏膜上，缓和炎性刺激而镇咳，同时甘草还能促进咽部和支气管黏膜分泌，使痰易于咳出，减少因痰液过多、无法排除导致的炎症反应[3]。文献表明陈皮对小鼠血清溶血酶含量、血清血凝抗体滴度、心血T淋巴细胞E玫瑰花环形成率有显著的增强作用，进而促进体液及细胞免疫，从而提高机体的抗炎能力[6]。

　　3.2.2 该组方中茯苓的重要成分茯苓多糖具有增强免疫功能作用，能显著提高白细胞吞噬活性[7]。有研究表明[3，8]：羧甲基茯苓多糖参与到机体免疫调节的多个环节;针对性地保护免疫器官、增加细胞免疫功能，增强抗感染能力;茯苓素在体内可诱导小鼠腹腔巨噬细胞进入激活状态，激活的巨噬细胞体积增大与外界接触面积增加，增加其吞噬能力;组方剂中的党参成可促进抗体作用[9]，能显著增强网状内皮系统的吞噬功能[10]。同茯苓在药理作用上相互协同，显著纠正因慢性支气管炎而导致呼吸道及肺泡中吞噬细胞功能减弱。有文献报道黄芪能通过增加免疫球蛋白IgGl和IgG3水平，增强体液免疫，诱导干扰素生成等免疫调节作用来改变小鼠免疫功能低下状态，扭转病程[11]。总之，益气化痰方可增强细胞免疫和体液免疫。

　　3.2.3 表3说明高、中剂量益气化痰组方有明显祛痰效果。慢性支气管炎黏膜下腺体增生肥大和浆液性上皮发生黏液性化生，导致黏液分泌增多，出现痰液。痰液刺激迷走神经，产生咳嗽反射，出现咳痰。慢性支气管炎的患者，可以长期反复咳嗽、咳痰，痰液难以排出，因此很容易形成痰栓，堵塞气道，并且积痰的存在既不利于炎症消除，又加深慢性支气管炎病情发展。该组方中的甘草能促进咽部和支气管的黏膜分泌，同时上文提到的陈皮挥发物的主要成分柠檬烯也可刺激呼吸道黏膜，导致分泌增多[11，12];白芥子促进黏液分泌;而在气管支气管腺体中，分泌较稀液体的浆液腺泡占多数，约为黏液腺泡的2倍，因此气管腺分泌物增加，分泌物是较稀的液体，可稀释积痰，使痰液易于咳出，达到明显的祛痰效果。

　　3.3 结合图4可以看出各治疗组小鼠爬杆时间均有明显延长，以中剂量组效果最好，说明组方能够有效提高小鼠运动和抗疲劳能力。经有关实验证明[13]陈皮有一定的抗疲劳作用，并且有明显的强心作用，有文献表明[5，10，13]它能增强心肌收缩力、扩张冠状动脉、升高血压、提高机体应激能力，从而到达强心、抗休克、抗厥脱、回阳救逆的治疗效果;另外，党参也具有抗疲劳作用，其机制可能与提高其中枢神经系统的兴奋性提高机体活动能力有关,故而能减轻其疲乏感[10]。总之，在用药之后小鼠的身体素质显著提高。

　　【参考文献】

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　　2 陆再英，钟南山主编.内科学.第7版.北京：人民卫生出版社，2008.6364.

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