hCAP18/LL37基因转染对人肺癌细胞凋亡的影响

　　【摘要】 目的探讨基因转染人源抗菌肽hCAP18/LL37对人肺癌细胞A549凋亡的影响。方法将含人hCAP18/LL37的真核表达质粒瞬时转染人肺癌细胞A549细胞，48 h后细胞免疫组化染色检测A549细胞中Caspase3蛋白表达。结果重组基因瞬时转染A549细胞48 h后，免疫细胞化学染色与正常对照组细胞及转染空载体组细胞比较，转染重组基因组细胞Caspase3蛋白表达增加。结论hCAP18/LL37可以通过上调Caspase3蛋白表达使肿瘤细胞凋亡

　　【关键词】 hCAP18/LL37,瞬时转染,肺癌细胞,细胞凋亡

　　Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of antibacterial peptide hCAP18/LL37 on apoptosis of human lung cancer cell A549. MethodshCAP18/LL37 eukaryotic expression vector was transiently transfected into human lung cancer cell A549,after 48h expression of Caspase3 protein in A549 was detected by Immunohistochemical staining. ResultsThe recombinant A549 cells was transiently transfected,after 48h the protein expression of caspase3 was increased,compared with those in the control group. ConclusionhCAP18/LL37 gene transfection coould induce apoptosis by the upregulation of caspase3 protein expression.

　　Key words:hCAP18/LL37;transient transfection;lung cancer cells;cell apoptosis

　　抗菌肽广泛存在于多种生物体内，研究表明抗菌肽在机体天然免疫防御中具有重要作用[12]。其分子量小、热稳定、水溶性好，而且具有广谱抗菌性，同时具有调节免疫以及选择性杀灭肿瘤细胞等作用[3]。目前大部分化疗药物往往同时抑杀肿瘤细胞和正常细胞，毒性作用较大，因此，对于抗菌肽抑杀肿瘤细胞机制的探讨是目前研究的热点。hCAP18/LL37是Cathelicidins家族中唯一存在于人体中的抗菌肽，在人体组织中广泛分布，是天然免疫的重要分子[4]。研究发现，抗菌肽还可以调动机体免疫机能，激活caspases途径诱导细胞凋亡[5]。本实验拟通过抗菌肽hCAP18/LL37瞬时转染人肺癌A549细胞，研究其对A549细胞凋亡的影响，为抗菌肽应用于肿瘤临床治疗提供实验依据。

　　1材料与方法

　　1.1主要材料及试剂

　　真核表达载体pcDNA4/MycHishCAP18/LL37由吉林大学基础医学院免疫学教研室袁红艳博士惠赠;A549细胞由吉林医药学院病原教研室提供;PolyFect@ Transfection Reagent购自QIAGEN公司;SP免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。

　　1.2细胞培养

　　37°C、5%CO2条件下，用含10%FCS的DMDM培养基培养人肺癌A549细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化传代。

　　1.3免疫细胞化学法瞬时转染48 h后的正常对照组、转染空载体组、转染重组基因组细胞，采用SP试剂盒进行免疫组织化学染色，检测Caspase3表达情况。具体染色过程：每张切片加50 μL左右稀释的一抗，作用60 min，每张切片滴加50 μL左右的生物素标记的二抗(羊抗鼠)，37°C孵育30 min，PBS冲洗5 min×3次,弃PBS。每张切片加入链霉素抗生物素过氧化物酶50 μL，作用30 min，用PBS冲洗5 min×3次。弃PBS每张切片滴加新配制的DAB显色液，镜下观察控制显色反应，自来水冲洗终止反应，苏木素染色2 min，自来水冲洗。迅速过盐酸酒精溶液，自来水冲洗。过氨水返蓝，自来水冲洗。依次70%酒精(1次)、95%酒精(2次)、无水乙醇(3次)脱水。过二甲苯3次，每次1 min透明。中性树胶固定封片。

　　1.4结果观察标准胞质内出现棕色染色颗粒为阳性细胞。Olympus显微镜观察并拍照，每张玻片随机选取400倍视野。

　　2结果

　　hCAP18/LL37基因转染对Caspase3蛋白表达的影响见图1。其中A为正常对照组细胞中Caspase3的表达，B为转染pcDNA4/MycHis空质粒组细胞中Caspase3的表达，C为转染pcDNA4/MycHisLL37组细胞中Caspase3的表达。　　A.正常对照组B.转染pcDNA4/MycHis空质粒组C.转染pcDNA4/MycHisLL37组图1hCAP18/LL37基因转染对Caspase3蛋白表达的影响(SP染色，400×)

　　3结论

　　在恶性肿瘤的发生和发展中，细胞凋亡对肿瘤的抑制起着重要作用，诱导肿瘤细胞凋亡的相关研究已成为近几年抗肿瘤研究的热点之一[6]。Caspase3被称为“死亡酶”，激活的Caspase3能使许多与细胞结构、细胞周期及DNA修复等相关的蛋白或激酶失活，从而导致细胞凋亡[7]。Caspase3是凋亡级联反应的一个重要执行者，其过量表达可引发细胞凋亡，在凋亡过程中，其可以对关键性蛋白进行酶切从而引起凋亡的激活，最终引起染色体DNA降解和细胞解体。因此，将活化Caspase3蛋白酶的出现作为细胞凋亡的标志。本实验采用免疫细胞化学法观察细胞凋亡相关基因Caspase3蛋白表达情况，结果显示Caspase3蛋白表达增加。hCAP18/LL37基因转染诱导人肺癌A549细胞发生凋亡可能与其改变凋亡相关蛋白Caspase3的表达有关。

　　总之，hCAP18/LL37基因瞬时转染人肺癌A549细胞48 h后，可以通过上调Caspase3的蛋白表达诱导肿瘤细胞凋亡。本实验为抗菌肽应用于肿瘤基因治疗提供了一定实验依据，但对于抗菌肽hCAP18/LL37基因的诱导凋亡机制还有待于进一步研究。

　　【参考文献】

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