不同来源人的间充质干细胞分离与基本生物学特性的研究

　　【摘要】 目的比较人羊水源性及脐血源性的间充质干细胞(MSCs)分离、培养及其生物学特性，为组织工程选取种子细胞提供实验依据。方法用贴壁分离培养的方法分离两种来源的间充质干细胞，观察其形态与生长曲线，并用细胞化学染色的方法测定其生物化学特性。结果两种来源的标本均可成功分离出MSCs，但是孕中期羊水源性MSCs增殖能力要明显强于新生儿脐血源性的MSCs，二者有相似的生物化学特性。结论孕中期羊水与新生儿脐血来源的MSCs是很好的组织工程种子细胞,新生儿脐血来源的MSCs的增殖能力相对较弱，应用受到一定的限制。

　　【关键词】 孕中期羊水,间充质干细胞,脐血

　　Abstract:ObjectiveTo compare isolation methods and biology characteristics of mesenchymal stem cells(MSCs) in secondtrimester amniotic fluid and cord blood to provide organizational projects with experimental basis for selecting seed cells. MethodsMSCs from two different sources were isolated by adherence culture,their morphous and growth curve were observed;Cytochemical staining was applied to analyze the biochemical characteristics of MSCs. ResultsMSCs could be successfully isolated from both of the two samples.MSCs from different sources had similar biochemical characteristics. ConclusionSecondtrimester amniotic fluid and cord blood were better seed cells for organizational projects.MSCs from cord blood and midpregnancy amniotic fluid were weaker in reproductive capacity and their application should be limited.

　　Key words:secondtrimester amniotic fluid;mesenchymal stem cells;cord blood

　　间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潜能,是细胞治疗及基因治疗的理想种子细胞。已有研究显示羊水[1]和脐血[2]可以分离出MSCs，那么这两种来源的MSCs有哪些异同呢?为此本研究将对孕中期人的羊水及新生儿的脐血进行间充质干细胞的分离与培养，并对其基本生物学特性进行了比较研究，为组织工程选取种子细胞提供基础性实验依据，现报告如下。

　　1材料与方法

　　1.1标本来源

　　羊水标本取自2008年3月至2010年3月吉林医药学院附属465医院妇产科，妊娠在15～22周的引产羊水35份;32份脐带血标本取自正常足月剖腹产或足月正常产乙肝病毒检测阴性的孕妇。取标本前均征得孕妇本人同意，研究获得吉林医药学院附属465医院道德伦理委员会批准。

　　1.2主要试剂与仪器

　　PRMI1640(GIBCO BRL)，胎牛血清(GIBCO BRL)，马血清(GIBCO BRL)，1.077×103 g/L Ficoll淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)，细胞化学染色试剂盒(BASO公司)，CO2培养箱(Forma Scientific公司)，荧光倒置显微镜(TE300,Nikon公司)。

　　1.3孕中期羊水MSCs的分离与培养羊水标本在室温下1500 r/min离心5 min，弃上清，加入含10%胎牛血清(FBS)的PRMI1640培养液，制成密度为(1～5)×105个/mL的单细胞悬液，接种到φ60 mm塑料培养皿中，置饱和湿度、37 ℃、5% CO2培养箱中培养。第3天首次换液，去除非贴壁细胞，当类成纤维样细胞铺满平皿达80%时，用0.25%的胰酶消化，用PRMI1640培养液制成浓度为4×104个/mL的细胞悬液，接种到新培养皿中，记为第1代(P1)。每3 d用含10% FBS的PRMI1640培养液换液1次，细胞生长达到90%融合时按1∶4的比例传代。

　　1.4新生儿脐带血MSCs的分离与培养无菌条件下取正常足月剖腹产或足月正常产乙肝病毒检测阴性孕妇的脐带血50～80 mL，放于含CPDA1复合抗凝剂的采血袋中，所有样本均在采集后12 h内进行分离;将脐血用等量的DHank′s液稀释制成细胞悬液,细胞悬液沿管壁缓慢加入到相对密度为1.077×103 g/L Ficoll人淋巴细胞分离液上层,其比例为2∶1,注意液面清晰分层，以1 500 r/min进行梯度离心20 min，然后缓慢吸取中间交界面细胞悬液至另一离心管，获得含人MSCs的单个核细胞悬液，加入含10%FBS的PRMI1640完全培养基,吹打并计数。以5×105个/mL的密度接种到φ60 mm培养皿中，48 h首次换液,以后每3 d换液。换液用含10%FBS的PRMI1640完全培养基。在细胞80%左右融合时,用0.25%胰酶室温消化5 min，适量小牛血清终止消化反应，吸管轻轻吹打，转入离心管中1 500 r/min离心10 min，弃上清，按1∶3比例传代。

　　1.5MSCs的生长曲线测定将传至3、5、8代的MSCs制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/mL，接种于24孔培养板，每孔0.5 mL;每天取3孔，消化后进行细胞计数，共8 d。以时间(d)为横坐标,细胞数为纵坐标，绘制生长曲线。

　　1.6MSCs的代谢情况检测传3代的羊水MSCs按5×104/mL密度接种于φ35 mm的培养皿中。2 d后分别对培养皿中的细胞进行POX、SB、PAS、αNAE和ALP细胞化学染色，显微镜观察、拍照。同样，新生儿脐血源性MSCs取第3代以后细胞进行细胞化学染色分析。

　　2结果

　　2.1羊水MSCs

　　从羊水中分离出的细胞,将之接种于PRMI1640培养基中,2～3 d部分细胞开始贴壁,4～7 d逐渐出现贴壁的MSCs,开始为圆形,逐渐伸出突起,呈成纤维样、梭形，最初散在分布,后逐渐在局部形成集落生长(图1)。一周以后MSCs迅速扩增(图2),约10 d后可达80%～90%融合,扩增变缓,即可传代。传代后羊水MSCs 5～6 h即可贴壁,2～4 d生长迅速,1周后即可再次传代。形态为均一的成纤维样的MSCs，呈漩涡样生长,即为羊水源性的MSCs(图3)。

　　2.2新生儿脐血MSCs

　　脐血的单个核细胞悬液接种于φ60 mm的塑料培养皿中，原代培养6 d后，在倒置显微镜下可见单个或少量呈集落生长的贴壁细胞，形态大多为椭圆形或短梭形，凸出于培养皿表面。粘附于贴壁细胞之上的造血细胞和其他细胞在换液的过程中逐渐被清除，10 d后就形成细小纤维状小集落，20～25 d后细胞集落不断地扩大并形成融合超过80%，细胞形态大多呈短梭形。传代培养后的脐血MSCs 12 h即可贴壁，4～14 d生长迅速,10 d后即可再次传代,细胞呈短梭形生长(图4，25×)。10代左右细胞生长状态开始急剧衰退,细胞颗粒化严重，增殖速度严重放慢。

　　2.3MSCs的生长曲线

　　人羊水源性MSCs生长曲线呈“S”形，传代后第1、2天为潜伏适应期，从第3天开始细胞增殖加速并进入对数生长期，第6至7天达到高峰，以后进入平台期。通过对第3、5、8代新生儿脐血源性的MSCs细胞计数,绘制的生长曲线形状与羊水源性MSCs生长曲线形状相似，呈S形(图5);传代第1至3天为生长停滞期，第4对14天为快速增殖期，后即进入平台期。随传代次数增加,MSCs的增殖能力有所减弱。第3、5代细胞增殖能力最强,第8代细胞较第3、5代细胞增殖能力减弱较明显，但亦呈“S”形。

　　2.4不同源性MSCs的生物化学特征

　　羊水源性MSCs及脐血源性MSCs具有相同的生物化学特征，染色结果都显示：POX、SB染色为阴性，αNAE、PAS为强阳性，ALP染色有1%为弱阳性，这与文献报道的MSCs的染色特点相一致[34]。进一步证明了培养出的成纤维样细胞为MSCs。图1.4 d羊水贴壁细胞图2.7 d羊水贴壁细胞图3.10 d羊水贴壁细胞图4.10 d脐血贴壁细胞图5.羊水脐血MSCs生长曲线

　　3讨论

　　间质干细胞具有多向分化潜能，是细胞组织工程的首选种子细胞之一。然而人骨髓中的MSCs含量较少，大约104～105个骨髓单个核细胞中只含有一个MSCs[5],这显然难以满足细胞组织工程的实际需要，因此寻找MSCs的来源和如何在体外分离扩增MSCs就显得较为重要。为了更好的得到MSCs，我们分别对孕妇的羊水和新生儿脐带血进行了MSCs的分离，并对所得的MSCs生物学特性进行了比较，以期得到更好的MSCs来源。

　　间充质干细胞的分离,我们主要参考了Friedenstein建立的MSC分离方法并做了适当的改进，利用MSCs的粘附性来获得MSCs。本实验将羊水细胞和脐血单个核细胞接种于含10%胎牛血清PRMI1640培养基中，3 d后去除未贴壁细胞，待细胞单层长满80%后，用胰酶消化传代，本法可去除一些贴壁的非间质干细胞，经过几次传代后即可得到相对较纯的MSCs。

　　本研究中采用孕妇的羊水和新生儿脐带血标本都可以成功地得到MSCs，这与国外报道的相一致[6]，可作为未来组织工程学的一个不可或缺的来源[7]。两者在形态和生物学特性上都非常类似，但是脐血源性的MSCs形态呈短梭形。明显不同的就是人羊水源性MSCs增殖能力明显要优于脐血源性MSCs,这一点可以从生长曲线与传代能力都得到较好体现。人羊水源性MSCs群体倍增时间较脐血源性MSCs倍增时间短，且人羊水源性MSCs的传代能力明显强于脐血源性MSCs。

　　综上所述，与脐血源性间充质干细胞增殖能力相比,羊水MSCs的获得更为可观，是组织工程种子细胞的又一可靠来源。

　　【参考文献】

　　[1]冯建勋,腊晓林,马艳,等.两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞及其向神经元样细胞诱导分化的实验研究[J].中国危重病急救医学,2009,21(12):729733.

　　[2]田少奇，王丽，孙康，等.人脐血间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究[J].中国骨与关节损伤杂志，2009，24(2)：108111.

　　[3]Zipori D.Mesenchymal stem cells:harnessing cell plasticity to tissue and organ repair[J].Blood Cells Mol Dis,2004,33(3):211215.

　　[4]李现铎，耿红全，朱哲，等.羊水作为间充质干细胞来源的可行性研究[J].中华小儿科杂志，2006，27(9)：449452.

　　[5]Pittenger M F,Mackay A M,Beck S C,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411):143147.

　　[6]Romanov Y A,Svintsitskaya V A,Smirnov V N.Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells:candidate MSClike cells from umbilical cord[J].Stem Cells,2003,21(1):105110.

　　[7]Da Sacco S,Sedrakyan S,Boldrin F,et al.Human amniotic fluid as a potential new source of organ specific precursor cells for future regenerative medicine applications[J].J Urol，2010,183(3):11931200.