对一种源于蜗牛的壳聚糖水解酶的不同纯化方法的选择

　　【摘要】 目的 研究源于蜗牛的壳聚糖水解酶的纯化方法,得到壳聚糖水解酶的纯品，从而为氨基酸序列分析、基因克隆及工业菌制备奠定前期基础。方法 对比疏水作用层析、离子交换层析、羟基磷灰石柱(HA)层析、凝胶过滤层析等方法纯化蜗牛酶的实际效果，确定纯化的最佳条件，从而设计出最合理的纯化方案。结果 分别用苯基琼脂糖柱层析， DEAE-Sepharose离子交换层析，羟基磷灰石柱层析，Sephacryl S-300凝胶过滤层析分离蜗牛酶，最终确定为用弱阴离子交换填料DEAD-Sepharose,疏水作用层析，凝胶过滤层析进行分离。结论 本文探讨了蜗牛酶的不同纯化方法，建立了一种从蜗牛酶中分离高效高纯度壳聚糖水解酶的方法，为壳寡糖的酶解工业生产提供了新方法。

　　【关键词】 壳聚糖 壳聚糖水解酶 蜗牛酶

　　Election of Different Purification of Chitosanase from Snail

　　SU Li, XIN Yi

　　(Science Laboratory Center of Liao ning medical college,Jinzhou 121001 China;Biotechnology of Dalian Medical University,Dalian 116027 China)

　　【Abstract】 Objective To compare the different purification methods of chitosanase and explore the optimal purification conditions. Methods Hydrophobic interaction, ion exchange, gel filtration, DEAE-Sepharose, Sephacryl S-300, and hydroxylapatite chromatography media were run in this experiment. Results The optimal purified methods were hydrophobic interaction chromatography and DEAE-Sepharose and gel filtration chromatography. There were divided five spikes of proteins and three spikes of the enzyme activity,the enzyme activity is higher than other methods. Proteins were needed on 0.35mol/L of NaOH eluting by DEAE-Sepharose. There were divided two spikes of proteins by the Sephacryl S-300 column. Conclusions This paper investigate different purified methods of helicase and set up a high performance method of separate chitosanase from helicase to provide new approach for enzymolysis industry of oligosaccharide.

　　【Key words】 Chitosan; chitosanase;helicase

　　壳聚糖是由2-氨基-D-葡萄糖(GlcN)和2-乙酰氨基-D-葡萄糖(GIcNAc)通过 -1，4糖苷键连接而成的天然高分子多糖。由于其相对分子量大，分子内强大的氢键引力，壳聚糖不溶于水，在人体内不易被吸收，从而使其应用受到限制。壳聚糖水解酶(Chitosanase，EC3.2.1.132)是一类能水解壳聚糖的水解酶，广泛存在于一些真菌、放线菌、细菌中，在植物、病毒中也发现有此酶的存在[1-4]。壳聚糖经酶水解可形成壳寡糖，具有抑制细菌和真菌生长，调节机体免疫和抗肿瘤等功能[5-7]。由酶法水解壳聚糖制备壳寡糖反应条件温和，生产工艺无污染，产品质量好，受到食品、化学工业、生物医学等领域的青睐。对于壳聚糖水解酶国内外已有较多的研究报道，包括酶的纯化、理化性质、作用机理、结构功能等。但由于大多数微生物产壳聚糖水解酶的活性低，生产成本相对较高，一直影响壳寡糖的酶法生产。软体动物蜗牛消化道中含有降解多种多糖的水解酶，因此我们选定将蜗牛酶作为对象，力求分离纯化出活性最强的壳聚糖内切酶。

　　1 材料与方法

　　1.1 样品

　　蜗牛酶(纯度90%)，上海方向西巴斯科技发展有限公司;壳聚糖(脱乙酰度约90%)，济南海得贝海洋生物工程有限公司。

　　1.2 试剂

　　Tris，美国PROMEGA公司;DEAE-SepharoseTM Fast Flow(DEAE-Sepharose)、Sephacryl S-300和Phenyl SepharoseTM6Fast Flow(low sub)，瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司;羟基磷灰石(HydroxylaPatite，HA)，美国Bio-Rad Laboratories公司。

　　1.3 仪器

　　层析拄，上海锦华层析设备厂;LBS-100型自动部分收集器，上海沪西分析仪器厂;JM-250小型数显电泳仪，大连竞迈生物科技有限公司;MV-Ⅱ型垂直电泳槽，大连竞迈生物科技有限公司;752分光光度计，上海第三分析仪器厂;354型Multiscan Ascent酶标仪。

　　1.4 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[8]

　　取样品液0.5mL，加入2.5mL考马斯亮蓝染色液，静止5min，经分光光度计测定595nm处吸光度。将上样量等倍减小，经酶标仪测定595nm处吸光度。以牛血清白蛋白为标准制作标准曲线，计算样品液中的蛋白质含量。

　　1.4.1 蛋白质浓度对酶活性测定的影响

　　1.4.1.1 蜗牛酶与考马斯亮蓝反应(线性稀释)

　　取5支试管，按表1分别加入蜗牛酶，双蒸水及考马斯亮蓝。

　　表1 蜗牛酶与考马斯亮蓝反应(线性稀释)(略)

　　方法同表1取5支试管，蜗牛酶做倍比稀释。1μL溶于45%(NH4)2SO4的蜗牛酶加入9μL的双蒸水，从中取出1μL做倍比稀释，最后1μL弃去。a-yhbb07-5

　　表2 蜗牛酶与考马斯亮蓝反应(倍比稀释)(略)

　　1.5 酶活性测定

　　取1mg蜗牛酶按酶与底物质量比1∶20加入到100mL 0.5%壳聚糖溶液中(溶于体积分数为1%醋酸)，用1mol/L NaOH溶液调pH至4.8，于40℃ 反应1.25h, 120℃水浴5min灭活。以80min产生1mol还原糖的酶量为一个活性单位。

　　1.6 对羟基苯甲酸酰肼(P-Hydroxybenzoic Acid Hydrazide,PAHBAH)法测定还原糖含量[9]

　　取酶与底物的反应液250μL，加入150μL PAHBAH试剂(质量浓度为5% PAHBAH溶于 0.5mol/L NaOH中)以及600μL 的0.5mol/L NaOH，振荡混匀，密闭120℃加热15min，在4 000*g下离心10min，于410nm处测定吸收值。以氨基葡糖盐酸盐为标准制作标准曲线，计算样品中还原糖摩尔数。

　　1.7 疏水作用层析[10]

　　将20mL苯基琼脂糖装于直径1.8cm高18.1cm层析柱中，上柱总蛋白量46.5mg，用3倍柱体积层析缓冲液(20mmol/L，pH7.0磷酸盐缓冲液中溶解1.5mol/L的硫酸铵)洗柱后，分步梯度洗脱，分别采用2倍体积的含1.5mol/L，1.35 mol/L，1.2 mol/L，1.05 mol/L，0.9 mol/L，0.75 mol/L，0.6 mol/L，0.45 mol/L，0.3 mol/L，0.15 mol/L，0 mol/L硫酸铵的pH7.0的磷酸盐溶液进行洗脱。每管4mL收集样品。测定蛋白质含量及酶活性。走电泳检测分离与纯化效果。

　　1.8 离子交换层析[11]

　　将10mL弱阴离子交换层析填料DEAE-Sepharose装于直径1.8cm高18.1cm的层析柱中，用10mL 1mol/L NaOH溶液洗至碱性，再用pH 8.5的0.01mol/L Tris-TCl缓冲液平衡，直至洗脱液pH值为8.5。取50mg蜗牛酶上样于填料顶部。在样品缓缓浸入填料后再加入0.5mL Tris-HCl。然后梯度洗脱，分别采用1倍柱体积的含0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L、0.2mol/L、0.25mol/L、0.3mol/L、0.35mol/L、0.4mol/L、0.45mol/L、0.5mol/L NaCl的0.01mol/L Tris-HCl缓冲液进行洗脱。每管2.5mL收集样品，测定蛋白质含量及酶活性。

　　1.9 羟基磷灰石柱(HA)层析[11]

　　5mL的羟基磷灰石装于直径1.8cm高18.1cm的层析柱中。用10倍pH6.9的 0.001mol/L磷酸盐缓冲液洗柱平衡至稳定。取10.8mg蜗牛酶上样于填料顶部，待样品缓缓浸入填料之后再加入0.5mL 0.005mol/L磷酸盐缓冲液。分别用4倍、3倍、3倍、3倍、6倍的pH6.9的0.001mol/L、0.005mol/L、0.01mol/L、0.1mol/L、0.5mol/L的磷酸盐缓冲液洗柱。收集洗脱液检测蛋白质含量及酶活。

　　1.10 凝胶过滤层析[12]

　　将Sephacryl S-300填料装于直径0.9cm高57.4cm的层析柱中，加入适量蜗牛酶待缓慢浸入后，加入0.2mL的缓冲液，用pH6.9 0.001mol/L的磷酸盐缓冲液洗脱。收集洗脱液检测蛋白质含量及酶活。

　　1.11 变性条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

　　1.11.1 溶液配制

　　电泳缓冲液(pH8.3)：取14.49g甘氨酸，3.02gTris,加100mL10%SDS，加水至1升，4℃保存;染色液：考马斯亮蓝R-250 2.5g，甲醇500mL，70mL冰醋酸，溶解后补足水至总体积1 000mL;脱色液：甲醇300mL，冰醋酸70mL，补足水至1 000mL。

　　1.11.2 凝胶配方(表3)

　　表3 SDS-PAGE胶的组分(略)

　　1.11.3 上样及展开

　　上样前将80μL酶样品与20μL的上样缓冲液(质量浓度为25%甘油,14.4mmol/L的巯基乙醇，60mmol/L Tris-HCl pH6.8和少许溴酚蓝)混合后，沸水中加热5～10min。电泳稳定电流35～40mA，直至最前端距低槽1.5cm左右。

　　2 结果

　　2.1 疏水作用层析

　　由图1可见蜗牛酶经过疏水作用层析填料苯基琼脂糖在硫酸铵的盐梯度洗脱下可粗分为5个峰，酶活性峰可分为3个活性峰。第1个酶活性峰是未结合到苯基琼脂糖上的洗脱峰，大部分蛋白质集中在第2个和第3个酶活性峰，其中第2个酶活性峰的蛋白质含量比第3个酶活性峰的含量低，而酶活性峰较高，比活性比第3个酶活性峰高。由此图可看出疏水作用层析能很好的分离蜗牛酶。

　　2.2 离子交换层析

　　由图2可见，蜗牛酶经离子交换层析填料DEAE-Sepharose可粗分为8个峰，酶活性峰可分为4个活性峰,第1个活性峰是未结合到层析填料的酶的活性峰,第2个峰酶的活性较低,酶的活性峰集中在第3个和第4个峰,此两个峰是用0.35mol/L的NaOH洗脱。由此图可看出DEAE-Sepharose能很好的分离蜗牛酶。

　　2.3 羟基磷灰石柱(HA)层析

　　由图3可见羟基磷灰石柱层析,在pH6.9的磷酸盐缓冲液的洗脱条件下将蜗牛酶分成5个峰，第1、2个洗脱峰的蛋白质含量较高，其次是第4个洗脱峰，然后是第5个洗脱峰，最后是第3个洗脱峰，酶活性峰与蛋白质含量峰相符合集中在第1、2个峰和第4个峰。第1、2个峰是未结合到层析填料的蛋白质。其中第4个峰较之第1个峰和第2个峰其比活性最高。

　　2.4 凝胶过滤层析

　　由图4可见凝胶过滤层析填料Sephacryl S-300将蜗牛酶分成2个峰。

　　2.5 电泳法

　　图5是蜗牛酶经硫酸铵分级沉淀及疏水作用层析分离纯化，去除了部分杂蛋白。

　　3 讨论

　　本文比较了疏水作用层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、羟基磷灰石柱层析、盐析法分离纯化壳聚糖水解酶。经疏水作用层析可把蜗牛酶分出来3个峰，分离效果较好，可以采用此方法进行分离纯化。离子交换层析是利用生物大分子与带电介质之间的可逆吸附，及生物大分子之间所带净电荷的微小差异来达到分离目的。最常用的弱离子交换配基有二乙基氨基乙基(diethylaminoethl,DEAE) 和羧甲基集团(Carboxymethyl,CM)，前者是阴离子交换剂，后者是阳离子交换剂。强离子交换配基有阴离子交换配基四乙基铵基(quaternary aminiethyl, QAE)和阳离子交换配基磺酸丙基(sμLfopropyl, SP)。本实验结果表明，活性蛋白质以中性和酸性蛋白质为主。故我们选弱阴离子交换树脂DEAE。通常阳离子交换剂选择酸处理，阴离子交换剂则选择碱处理。DEAE选择碱处理，使之带上正电荷并吸引相反离子OH-[13]。对于阴离子交换层析，效果较好的缓冲液为Tris[14]。所以在本实验中采用pH8.5 Tris-HCl作为缓冲液使相当一部分蛋白质带上负电荷，与离子交换剂所吸引的OH-进行交换;用起始缓冲液充分洗脱使未吸附物质洗出，再通过增加溶液中离子强度，使吸附到交换剂上的物质根据其静电力的大小而不断竞争性的解脱下来。在本实验中DEAE-Sepharose可将蜗牛酶大致分为8个峰，经过酶活测定得知，0.35M NaCl洗脱下来的蛋白质酶活性强。凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)又称为大小排阻、凝胶排阻、分子筛或凝胶过滤层析[15]。由图4得知SephacrylS-300填料可将粗酶分成2个峰。用羟基磷灰石柱层析分离纯化壳聚糖水解酶，由于蛋白峰和活性峰的趋势是一致的，分不出比活性高的各个峰，故此法不被采用。

　　综上所述，选择疏水作用层析、离子交换层析、凝胶过滤层析相结合，进行合理而有效的分步纯化。本文确定的纯化步骤高效、简便、可操作性强，并且能够进行工艺放大，为将来的工业生产奠定基础。

　　(此文图1—5见附页2)(略)

　　【参考文献】

　　[1] Chiang Chui liang，Chang Chen.tien，Sung Hsien—Yi Purification and Properties of chitosanase from a mutant of Bacillus Subitilis IMR.NKI[J].Enzyme and Microbial Technology,2003，32：260-267.

　　[2] Somasherkar D，Joseph R.Chitosanases properties and applications：A review [J].Biotechnol APPl Biochem，2000，32：197.

　　[3] Osswald W F，McDonald R E，Niedz R P，et al. Quantitative fluoro一metric analysis of plant and microbial chitosanase[J].Anal Biochem，1992，204(1)：40-46.

　　[4] Sun L，Adams B，Gurnon J R，et al.Characterization of two chitinase genes and one chitosanase virology[J].1999，263(2)：376-387.

　　[5] No Flong Kyon，Young Park Na，Ho Lee Shin，et al.Antibacterialactivity of chitosans and chitosan oligomers with different molecularweights[J].International Journal of Food Microbiology，2002,74(3):65-72.

　　[6] 竺国芳，赵鲁杭.几丁寡糖和壳寡糖的研究进展[J].中国海洋药物，2000，73(1)：43-46.

　　[7] 王中和，陆顺娟，胡海生，等.低分子壳多糖对癌症放疗患者免疫功能的影响[J].首部医科大学学报，1997，18(1)：80-82.

　　[8] Asryants R A, Duszenlova I D, Nagradova N K. Determination of sepharose-bound protein with coonassie brilliant blue G-250[J].Anal Biochem,1985,151:571-574.

　　[9] Leverm .A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates[J].Anal Biochem,1972,47(1):273-279.

　　[10]汪家政，范明.蛋白质技术手册[M].北京：科学出版社，2002:259-263.

　　[11] Harris E L V, Angal S. Protein purification Methods a practical approach[J].New York,Oxford University press,1999,202-215.

　　[12] Murry P. Deutscher Guide to Protein Purification Methods in Enzymology[J].Academic Press INC,1990,(182):238-581.

　　[13] 陶慰荪.蛋白质分子基础[M].北京:人民教育出版社，1981:20-95.

　　[14] Blanchard J S .Buffer for enzyme[J].Meth Enzymol,1984,104:404-414.

　　[15]Stellwagen,E.Gel Filtration[J].Meth Enzymol,1990.182:317-328.