孕酮对大鼠脑缺血再灌注后脑水肿的影响

　　【摘要】 目的 观察孕酮对脑缺血后脑水肿的影响，并从孕酮对血-脑屏障通透性的影响和抗氧自由基两方面进一步探讨其可能的作用机制。方法 雄性SD大鼠72只随机分为假手术组、I/R组、孕酮组。进行脑组织含水量测定，伊文思蓝渗透法血-脑屏障通透性定量分析，电镜下血-脑屏障超微结构形态学观察，脑组织SOD活性和MDA含量测定。结果 孕酮能明显减轻脑水肿，降低血-脑屏障通透性，抑制SOD活性的降低和MDA含量的增高。结论 孕酮抑制氧自由基的损害，降低血-脑屏障通透性，减轻脑缺血后脑水肿。

　　【关键词】 孕酮 脑缺血 脑水肿 血-脑屏障 氧自由基

　　Effect of Progesterone on Cerebral Edema

　　in Rats During Cerebral Ischemia/Reperfusion InjureLIU Zhan1, LI Ying1, LUO Jun-sheng2　　(1.Liaoning Medical University;　　2.Neurosurgery Department, the First Affiliated Hospital, Liaoning Medical University，Jinzhou 121000 China)

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of progesterone on cerebral edema during cerebral ischemia/reperfusion injure, and to approach its mechanism from both BBB (blood brain barrier) and free radical. Methods 72 male rats were randomly divided into three groups：sham-operation groups, model groups and progesterone groups. To observe the water content of the brain, and evaluate the functional changes with content of permeated Evens Blue，ultramicrostructure of BBB through electron microscope and assaying of SOD and MDA in the brain. Results Progesterone can obviously decrease the permeability of BBB, alleviate the degree of edema, increase the activity of SOD and lower the contents of MDA. Conclusions Progesterone can inhibit the damage of oxygen free radical, decrease the permeability of BBB, and alleviate the degree of edema after cerebral ischemia.

　　【Key words】 progesterone;cerebral ischemia;cerebral edema;blood brain barrier;oxygen free radical

　　脑缺血性疾病是严重危害人类健康的常见病、多发病，病死率和致残率高。脑损伤后的脑水肿及其引起的继发性损害是导致死亡和神经功能缺失的重要因素，严重影响预后。近年来孕酮(Progesterone,PROG)对神经系统损伤具有保护性作用的研究日益增多，研究发现PROG减轻脑外伤后脑水肿。本实验探讨PROG对脑缺血再灌注后脑水肿的影响，并从PROG对血-脑屏障通透性的影响和抗氧自由基两方面初步探讨其减轻脑水肿的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 雄性Spragu-Dawley大鼠 72只 体重220～250g 辽宁医学院实验动物中心提供。

　　1.1.2 试剂与仪器 孕酮(PROG)(上海通用药业股份有限公司，1mL：10mg);伊文思蓝(Sigma公司进口分装);硝酸镧(天津市德兰精细化工厂，分析醇);二甲砷酸钠(法国进口分装);SOD、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所);分光光度仪;日本JEM-1200EX透射电镜。

　　1.2 方法

　　1.2.1 模型制备 采用改良的Zea Longa动脉线栓法，制备左侧大脑中动脉闭塞(MCAO)局灶性脑缺血再灌注(I/R)动物模型，缺血2h，再灌注22h。

　　1.2.2 实验分组

　　(1)假手术组：仅切开颈部皮肤,暴露左侧颈总动脉。(2)I/R组：MCAO前30 min和MCAO后2 h、12h分别腹腔注射生理盐水0.5 mL/ kg体重。(3)孕酮组：MCAO前30min和MCAO后2h、12h分别腹腔注射PROG 4mg/kg 体重。每组实验动物24只，6只进行脑组织含水量测定;6只伊文思蓝颈总动脉推注，进行血-脑屏障通透性定量分析;6只硝酸镧心脏灌注，电镜下血-脑屏障超微结构形态学观察;6只进行脑组织SOD活性和MDA含量测定。

　　1.2.3 脑组织含水量的测定 大鼠再灌注22h后断头处死，快速取脑，去除大脑皮质表面软脑膜，切取直径约6mm的左额顶叶皮质和基地神经节，万分之一电子分析天平称取脑湿重，将标本置于90℃红外线干燥箱中24～48h，至恒重后称取干重(两次干重之差<0.2mg)。干湿重法测定脑组织含水量百分率，公式：脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

　　1.2.4 血-脑屏障通透性定量分析

　　1.2.4.1 伊文思蓝灌注 再灌注22h后经右颈总动脉推入2%伊文思蓝(4mL/kg)，1min内推完，30min后，经右颈总动脉灌注生理盐水冲洗，至左颈总静脉流出液清亮为止。

　　1.2.4.2 伊文思蓝定量分析 断头取脑，取左侧半球脑组织(损伤侧)，称取湿重，加入10%三氯乙酸沉淀蛋白质，无水乙醇匀浆，反复离心、洗涤3次，30倍于脑组织重量的甲酰胺提取脑组织内伊文思蓝，取上清液，分光光度仪600nm测定吸光度。空白对照液为甲酰胺、三氯乙酸和乙醇配成。根据标准曲线求得伊文思蓝含量(μg/g湿重)。

　　1.2.5 血-脑屏障超微结构的观察

　　1.2.5.1 透射电镜样本的制备 再灌注22h后将实验动物分别迅速开胸，质量浓度为3%的硝酸镧、0.1mol/L二甲砷酸钠和3%戊二醛混合液灌注心脏。灌注成功后，开颅取左侧半球脑组织(损伤侧)，作层厚2㎜冠状切片，额顶叶表面皮质取材(1mm3)。经外固定、脱水、漂洗、锇酸固定、包埋、修块、定位后，制备70nm的超薄电镜切片。

　　1.2.5.2 超微结构的观察 透射电镜下观察、拍照。

　　1.2.6 SOD活性及MDA含量测定 再灌注22h后将实验大鼠迅速断头取脑,于冰浴中迅速分离脑组织,去除小脑及脑干,取左侧半球脑组织(损伤侧)及相应对侧半球脑组织分别称重,按1∶10比例(每1g组织加10mL生理盐水)加入冰生理盐水,用组织匀浆机分别制成10%组织匀浆,离心10min(3 000r/min)。取上清液测定MDA含量，并用生理盐水将上清液稀释成1%组织匀浆,测定SOD活性。测定按试剂盒使用说明操作。

　　1.2.7 数据处理 采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析，计量资料用(x±s)表示，采用单因素方差分析及q检验。

　　2 结 果

　　2.1 脑组织含水量的比较 孕酮组与I/R组比较，脑组织含水量显著减少(P<0.05)，表明孕酮对局灶性脑缺血脑水肿有明显的防治作用(表1)。

　　2.2 伊文思蓝渗透量的比较 I/R组与假手术组比较，伊文思蓝渗透量显著增加(P<0.05)，而孕酮组伊文思蓝渗透量显著低于I/R组(P<0.05),表明局灶性脑缺血使血—脑屏障通透性增高，孕酮可抑制这种增高(表1)。表1 孕酮对缺血脑组织含水量和 伊文思蓝渗透量的影响注：*与I/R组相比，P<0.05

　　2.3 血-脑屏障超微结构的观察

　　假手术组硝酸镧颗粒均匀附着于毛细血管内壁，血管外无硝酸镧颗粒(图1)。I/R组血管基膜与胶质膜外以至组织间隙内可见大量硝酸镧颗粒(图2)。孕酮组仅血管基膜外见少量硝酸镧颗粒(图3)。

　　2.4 SOD活性与MDA含量测定 与I/R组相比，孕酮能显著抑制SOD活性的降低和MDA含量的增加，表明孕酮具有抗氧自由基的作用(表2)。表2 孕酮对SOD活性和MDA含量的影响注：*与I/R组相比，P<0.01

　　3 讨 论

　　脑缺血性损伤具有较高的致死率和致残率，严重危害人类的身体健康。近来研究发现，孕酮在神经系统损伤后的病理及病理生理过程中起着重要作用。Robert[1]等发现，雪旺细胞可以合成并分泌孕酮。Schumacher[2]等通过原位杂交技术证实外周神经可以将胆固醇转变为孕烯醇酮。Robel[3]等研究发现中枢神经系统的少突胶质细胞也可以利用胆固醇合成孕酮。可以看到，除了内分泌器官分泌孕酮外，中枢神经系统的少突胶质细胞、脊髓背角感觉神经元和雪旺细胞都能利用胆固醇合成孕酮。神经系统可以不依赖内分泌腺而维持其中有一定的PROG浓度[4,5]，因此PROG 又被称为“神经甾体”(Neurosteroids)[3,5]649-655,355-360。神经系统不仅可以合成孕酮，而且可以表达孕酮受体[6]。研究表明孕酮受体广泛分布于中枢神经系统，包括下丘脑、视前区、中脑、皮质、杏仁核、海马、尾-壳核和小脑[7]。以上研究成果为孕酮对神经系统损伤保护作用的研究奠定了理论基础。

　　脑损伤后的脑水肿和其引起的继发性损害是导致死亡和神经功能缺失的重要因素。我们的研究结果显示孕酮显著降低缺血后脑组织含水量。这与Betz等研究发现孕酮可以降低缺血脑组织水的含量，减轻脑水肿[8]相一致。脑缺血后脑水肿的发生机制主要有血管源性和细胞毒性两方面。由于缺血后自由基的大量释放，神经细胞内Ca2+ 超载，线粒体等细胞器受损，使神经细胞ATP生成减少，使大量水份从细胞外进入细胞内，引起细胞毒性脑水肿[9]。同时，自由基引起毛细血管内皮细胞膜酯质过氧化[10]，使血-脑屏障结构受损，通透性增高，从而引起或加重血管源性脑水肿。我们的研究显示，孕酮显著抑制SOD活性的降低和MDA含量的增加，具有抗氧自由基的作用。孕酮抑制氧自由基对脑细胞的损害，减轻细胞毒性脑水肿，同时抑制氧自由基对血-脑屏障功能结构的损害，减轻血管源性脑水肿，这可能是孕酮减轻脑缺血后脑水肿的机制之一。(此文图1-3见附页2)

　　【参考文献】

　　[1] Robert F,Guennoun R,Desamaud F,et al.Synthesis of progesterone in Schwann cells: regulation by sensory neurons[J].Eur J Neurosci，2001 ,13(5):916-924.

　　[2] Schumacher M,Guennoun R,Robert F,et al.Local synthesis and dual actions of progesterone in the nervous system: neuroprotection and myelination[J].Growth Horm IGF Res，2004 ,(14 Suppl A):S18-33.

　　[3] Robel P，Bourreau E，Corpechot C，et al.Neuro-steroids: 3 beta-hydroxy-delta 5-derivatives in rat and monkey brain[J].J Steroid Biochem，1987,27(4-6):649-655.

　　[4] Robel P，Baulieu EE.Neurosteroids: biosynthesis and function[J].Crit Rev Neurobiol,1995,9(4):383-394.

　　[5] Robel P,Young J,Corpechot C,et al.Biosynthesis and assay of neurosteroids in rats and mice: functional correlates[J].J Steroid Biochem Mol Biol，1995 ,53(1-6):355-360.

　　[6] McLaughlin ME，Jacks T.Progesterone receptor expression in neurofibromas[J].Cancer Res，2003 ,63(4):752-755.

　　[7] Mac　Lusky NJ,Mc　Ewen BS.Oestrogen modulates progestin receptor concentrations in some rat brain regions but not in others[J].Nature,1978 ,274(5668):276-278.

　　[8] Betz AL，Coester HC.Effect of steroid on edema and sodium uptake of the brain during focal ischemia in rats[J].Stroke,1990,21(8):1199-1204.

　　[9] Yang GY，Chen SF，Kinouchi H,et al.Edemo,cation cotent and ATPase activity after middle cerebral artery occlusion in rats[J].Stroke,1992 ,23(9):1331-1336.

　　[10]de Zwart LL，Meerman JH，Commandeur JN，et al.Biomarkers of free radical damage applications in experimental animals and in humans[J].Free Radic Biol Med,1999 ,26(1-2):202-226.