缺血后处理与缺血预处理对大鼠肝脏保护作用比较研究

　　【摘要】 目的 比较缺血后处理(ischemic postconditioning，IPo)及缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)对雌性大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法 建立大鼠肝脏缺血(40min)再灌注模型,将24只健康雌性Wistar大鼠随机分为假手术、缺血再灌注、缺血预处理及缺血后处理4组, 缺血预处理于缺血前给予3周期的5min缺血∕5min再灌，缺血后处理于缺血再灌注前先给予6周期的10s再灌∕10s缺血,24h后观察血清肝酶及肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)的含量变化,并行肝组织病理学检查。 结果 与缺血再灌注组相比,缺血后处理组及缺血预处理组肝酶的水平、肝组织SOD、NO、 NOS含量则显著升高(P<0.01)，而MDA含量明显降低(P<0.01)，同时肝组织病理形态学损伤亦明显减轻,而缺血后处理组与缺血预处理组相比无显著性差异(P>0.05)。结论 缺血后处理可通过抑制再灌注后氧自由基的过量生成,促进一氧化氮的生物学作用发挥保护效应，缺血后处理与缺血预处理的保护作用无显著差异。

　　【关键词】 肝脏 缺血再灌注损伤 缺血后处理 缺血预处理

　　Comparative Studies of the Protective Effects of Ischemic　Posconditioning and Preconditioning on Rat LiverXUE Cong-long1, FU Xiao-guang1, QI Zhi-min2　(1.Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University;　2.Department of Pharmacology, Liaoning Medical University, Jinzhou 121000 China)

　　【Abstract】 Objective To compare the protective effects of ischemic postconditioning and preconditioning on female rat liver.Methods With rat models of acute liver ischemia-reperfusion, 24 healthy female Wister were randomly divided into sham-operated, ischemia-reperfusion(IR), ischemic preconditioning(IPC) and ischemic postconditioning (IPo) groups. IPC was achieved by brief episodes of ischemia/reperfusion applied prior to ischemia, while IPo was achieved by a series of brief interruptions of reperfusion at the very onset of reperfusion. Then we observed the quantity change of SOD, MDA, NO and NOS in hepatic tissue after 24h and examined it pathologically. Results Compared with IR, the activity of plasma enzyme and the concentrations of malondialdehyde (MDA) in hepatictissue in IPC and IPo decreased sharply (P<0.01), while the concentrations of superoxide dismutase (SOD) and nitric oxide (NO) and nitric oxide synthase (NOS) increased significantly (P<0.01).Moreover, the hepatic tissue patheological damage also relieved obviously. The difference between IPo and IPC was not obvious (P>0.05). Conclusions IPo can attenuate hepatic ischemia-reperfusion injury by reducing the superoxide radical generation and increasing the effects of NO. There was no obvious difference between the protective effects of ischemic posconditioning and preconditioning.

　　【Key words】 liver; ischemia-reperfusion injury; ischemic posconditioning; ischemic preconditioning

　　缺血再灌注损伤是指缺血后再灌注,不仅不能使组织、器官功能恢复,反而加重组织、器官功能障碍和结构损伤。动物实验及临床研究已证实这一病理生理过程具有普遍性。自1986年Murry[1]发现缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)能增加犬的心脏对缺血的耐受性以来,IPC的保护作用已被证实具有器官普遍性。但其确切的发生机制目前尚未完全清楚。这种在缺血前短暂、反复的干预虽然有很好的作用，但是也有很大的局限，因为大部分缺血再灌注损伤是在不可预知的情况下发生。为了进一步应对缺血再灌注损伤，Zhao等[2]于2003年发现在缺血后给予反复、短暂的缺血及恢复血流能够减弱缺血再灌注对犬的心脏的损伤，并提出缺血后处理(ischemic postconditioning,IPo),使得对缺血再灌注损伤的研究成为热点,随后有许多文献对心脏的缺血后处理做了大量研究证实有保护作用。最近Tissier等人[3]提出通过雌激素类药物对新西兰兔进行后处理，证实药物后处理(Pharma-cological postconditioning)对心脏有保护作用。但是在国内外文献中对肝脏的缺血后处理的研究很少，孙凯等[4]用缺血后处理的方法研究并得出其能减弱缺血再灌注对雄性大鼠的肝脏的损伤。本实验以雌性大鼠为研究对象，并对后处理与预处理两种方法进行比较。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与主要试剂 本实验选用健康雌性Wistar雌性大鼠24只,体重200～250g,由辽宁医学院动物实验中心提供;丙二醛(MDA)﹑超氧化物歧化酶(SOD)﹑一氧化氮(NO)﹑一氧化氮合酶(NOS)分型试剂盒由南京建成生物工程公司提供。

　　1.2 动物分组及模型制备 实验动物术前12h禁食,自由进水,10%水合氯醛0.3mL∕100g腹腔内注射麻醉,取上腹正中切口,入腹后分离肝十二指肠韧带,充分显露第一肝门部并夹闭肝蒂,建立大鼠肝脏局部缺血再灌注模型。将24只大鼠随机分为4组,每组6只。假手术组(S组):入腹后仅分离肝十二指肠韧带,但不阻断肝门血供;缺血再灌注组(IR组):肝脏缺血40min再灌注;缺血预处理组(IPC组): 于缺血前给予3个周期的5min缺血∕5min再灌的预处理。再行肝脏缺血40min;缺血后处理组(IPo组): 缺血40min再灌注前先给予6个周期的10s再灌∕10s缺血的后处理。以上各组均恢复血流24h后取血、取肝脏组织。

　　1.3 血清谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)含量的测定 恢复入肝血流24h后经颈动脉取血2mL,常温1 200r∕min离心10min,取血清用全自动生化分析仪测定。

　　1.4 组织SOD﹑MDA﹑NO﹑NOS含量的测定

　　恢复入肝血流24h后再开腹切取新鲜左叶肝组织100mg,制备10%肝组织匀浆,4℃3 000r/min离心10min,取上清液按试剂盒说明黄嘌呤氧化酶法测定SOD,用硫代巴比妥酸比色法(TBA)测定MDA,硝酸还原酶法检测NO,NOS。

　　1.5 肝组织病理形态学观察 切取新鲜左叶肝组织,用质量浓度为100g/L的甲醛溶液固定24h,常规石蜡包埋切片,HE染色,光学显微镜观察;另切取新鲜左叶肝组织约1mm3,用容积分数2.5%戊二醛作前固定,1%锇酸后固定,梯度乙醇脱水后氧化丙烯浸透,环氧树脂包埋,超薄切片,铅2铀染色,在JEM-1200EX透射电镜下观察超微结构改变。

　　1.6 统计学处理 实验所得数据用均数±标准差(±s)表示,采用完全随机设计的单因素方差分析,多个样本均数间的两两比较采用Student-Newman-Keuls q检验,所有操作均以SPSS11.0统计软件完成,以P<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 血清ALT及AST含量变化再灌注后,IR、IPC、IPo组血清ALT及AST含量迅速升高,与S组比较差异均具有显著性(P<0.01);IPo、IPC与IR组相比,各指标水平明显下降,差异亦具有显著性(P<0.05),但IPo与IPC组差异尚无显著性(P>0.05) 见表1。

　　表1 血清ALT及AST的含量变化(±s，n=6)组别例数ALT(U/L)AST(U/L)S665.48±10.0581.72±10.63IR6315.57±19.15*486.22±18.99*IPC6289.78±14.30+452.42±12.04+IPo6294.47±12.43++456.03±17.27++

　　注：IR与S比较，* P<0.01; IPC、IPo与IR比较，+P<0.01; IPo与IPC比较,++ P>0.05

　　2.2 肝组织SOD、MDA、NO、NOS含量变化再灌注后,肝组织IR、IPC、IPo组中SOD﹑NO﹑NOS含量明显降低,而MDA水平则明显升高,与S组比较差异均具有显著性(P<0.01);IPo、IPC与IR组相比, SOD 、NO、NOS水平上升, 而MDA含量下降,差异亦具有显著性(P<0.01),但IPo与IPC组差异尚无显著性(P>0.05) 见表2、表3。

　　表2 肝组织中SOD及MDA 的含量变化(±s，n=6)组别例数SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)S6251.76±12.566.81±1.03IR6191.30±14.28*25.24±2.45*IPC6222.33±11.53+15.85±2.23+IPo6220.56±10.38++16.70±2.04++

　　注：IR、IPC、IPo与S比较，* P<0.01; IPC、IPo与IR比较，+P<0.01; IPo与IPC比较,++P>0.05

　　表3 肝组织中NO及NOS的含量变化(±s，n=6)组别例数NO(umol/g)T-NOS(U/mg)iNOS(U/mg)S60.95±0.1014.71±1.847.08±0.81IR60.42±0.13*7.02±1.36*1.46±0.42*IPC60.72±0.14+11.95±1.40+4.68±1.16+IPo60.69±0.10++11.65±0.89++4.04±1.18++

　　注：IR、IPC、IPo与S比较，*P<0.01; IPC、IPo与IR比较，+P<0.01; IPo与IPC比较,++P>0.05

　　2.3 肝组织病理形态学改变 光镜观察 可见S组肝小叶和肝窦结构正常，肝细胞、枯否细胞及肝窦内皮细胞形态正常; IR组肝细胞核大小不一,可见多数肝窦扩张,周围有大量红细胞淤积,肝窦及毛细血管内有微血栓形成; IPo 组组织结构破坏轻微仅见部分肝细胞轻度浊肿,偶有变性坏死及肝窦间隙少量红细胞淤积,肝小叶结构基本完整; IPC组的IPo 组接近(见图1)。

　　电镜结果: S组核膜正常,线粒体分布均匀,大小正常; IR组核膜增厚,呈高电子密度,线粒体明显肿胀, 数量增多，嵴断裂、消失, 粗面内质网颗粒脱落，基质呈高度毛玻璃状; IPo组线粒体结构基本正常,但可见其肿胀; IPC组与IPo组变化相近(见图2)。

　　3 讨 论

　　本实验用雌性大鼠作为研究对象不仅考虑到以往的研究多用雄性动物，更重要的是雌性动物在缺血再灌注损伤后存活率与存活时间明显高于雄性动物[5]。肝缺血再灌注损伤是临床外科治疗过程中较为棘手的问题,严重者可导致不可逆的肝功能损害，因此如何积极有效地对其进行控制是目前研究的主要问题之一。后处理是指缺血后再灌注的早期通过反复、短暂的缺血及恢复血流来达到对组织的保护作用。后处理最早于2003年被Zhao等[2]579-588发现，他们在缺血后给予反复、短暂的缺血及恢复血流能够减弱缺血再灌注对犬的心脏的损伤。次后的许多文献对后处理进行了研究，主要是针对后处理在心脏方面，研究对象包括犬、家兔、大鼠，研究方法包括干预时间10～30s、周期为3次或6次。唐铁龙等人[6]认为后处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用。目前所探讨的缺血后处理以及缺血预处理就是通过内源性保护机制起作用,保护机制还不是完全清楚，但是被大量文献证实。缺血预处理的保护机制在此以前有大量的文章论述。后处理的保护机制是在缺血后灌注早期涉及大量的细胞和分子事件的复杂过程。包括反应性氧物质的生成、减轻由缺血再灌注引起的炎症反应[7]、通过延迟清除释放的内源性腺苷起作用和增强内源性一氧化碳的作用及蛋白激酶C的活性[8]等。值得注意的是Kin等人[9]证实后处理成功的关键是处理的时间，如果后处理在缺血后重新灌流后1min才开始，那么就起不到保护作用。这种现象也被Yang[10]等所证实。

　　在肝脏方面预处理的保护作用被广泛承认。孙凯[4]104-107等人用后处理对肝脏缺血后再灌注损伤的大鼠研究证实后处理有保护作用。从本实验观察，后处理与预处理一样对肝脏同样有保护作用，无论是血清肝酶以及肝组织的SOD、MDA、NO、NOS预处理组与后处理组的保护作用均优于对照组具有统计学意义，但两者保护作用相似，无统计学意义。从各组的光镜及电镜比较，后处理组与预处理组优于对照组，而两者之间比较不明显。因此一旦损伤形成，预处理失去治疗的最佳时间，而后处理是缺血后的措施，在治疗缺血再灌注损伤上正好弥补预处理的不足，所以在临床上应用有很大的前景。

　　后处理对肝脏缺血再灌注损伤有显著的保护作用,并可加速肝脏缺血再灌注损伤这一病理过程的恢复,缩短其病程。就其保护肝脏缺血再灌注损伤的机制而言,结合本研究结果,认为抑制氧自由基产生过多以及促进NO的生物学作用能降低肝脏缺血再灌注时的损伤，其效果与预处理的效果相似。反应性氧物质(ROS)在减轻缺血再灌注损伤时起重要作用[11]。缺血后出现的ROS是与丙二醛水平的上升有关。后处理能通过减少超氧离子生成来保护缺血的组织，这种保护作用是与减少脂类氧化产物(丙二醛活性)相关。本实验观察到的IPo组MDA显著低于IR组与此相符。Yang等[10]1103-1110提出NO在后处理中的作用，并通过试验证实用NO的抑制剂可以对抗后处理的保护作用。NO可以减弱中性粒细胞的聚集、黏附，从而减轻缺血对组织和内皮细胞的损伤。本实验观察到的IPo组NO显著高于IR组与此相符。孙凯[4]104-107等人对后处理研究认为其保护作用通过抑制氧自由基的过量生成，改善微循环起作用的，与本实验观察到的SOD变化相似。但是在本实验后处理在恢复血流后立刻开始，缺血与恢复血流时间周期以秒为单位，而孙凯等人的实验方法略有不同，实验缺血与恢复血流时间周期以分钟为单位。

　　总上所述,后处理与预处理对肝脏缺血再灌注损伤同样具有保护作用，后处理的保护机制不完全清楚。因其在处理上的优势，使得在临床上有很大的发展空间，必将引起临床医师的青睐。(此文图1-2见附页1)

　　【参考文献】

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　　[3] Tissier R, Waintraub X ,Couvreur N, et al. Pharmacological postconditioning with the phytoestrogen genistein[J]. J Mol Cell Cardiol, 2007,(42)：79–87.

　　[4] 孙凯,刘志苏,孙权.缺血后处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用[J].武汉大学学报(医学版)，2004，25(2):104-107.

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　　[6] 唐铁龙,卢一平,周梭,等.缺血后适应对大鼠早期急性肾缺血再灌注损伤的保护作用[J].移植杂志，2006，9(3)：131-135.

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　　[8] Philipp S, Yang X-M , Cui L, et al. Postconditioning protects rabbit hearts through a protein kinaseC-adenosine A2b receptor cascade[J]. Cardiovascular Research, 2006,(70) 308 – 314.

　　[9] Kin H, Zhao Z-Q, Sun H-Y, et al. Postconditioning attenuates myocardial ischemia–reperfusion injury by inhibiting events in the early minutes of reperfusion[J].Cardiovasc Res, 2004,(62):74 – 85.

　　[10] Yang X-M, Proctor JB, Cui L, Krieg T, et al.Brief coronary occlusions during early reperfusion protect rabbit hearts by targeting cell signaling pathways[J]. J Am Coll Cardiol, 2004,(44):1103–1110.

　　[11] Jeroudi MO, Hartley CJ, Bolli R. Myocardial reperfusion injury: roleof oxygen radicals and potential therapy with antioxidants[J].Am J Cardiol, 1994,(73):2B–7B.