Livin与Bcl-2蛋白在乳腺癌中的表达及其意义

　　【摘要】 目的 探讨凋亡抑制基因Livin蛋白在乳腺癌组织中的表达、临床意义及其与Bcl-2蛋白的关系。方法 应用免疫组织化学SP法检测90例乳腺癌、30例乳腺良性病变和15例乳腺癌旁组织中Livin和Bcl-2蛋白的表达情况。结果 Livin和Bcl-2蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率分别为67.8%(61/90)和65.6%(59/90)，与癌旁组织和乳腺良性病变比较，差异有显著性(P<0.05)。Livin蛋白在乳腺癌中的表达与肿瘤大小，组织学类型，组织学分级及淋巴结转移无关(P>0.05)，但随临床分期的增加而升高(P<0.05);Bcl-2蛋白的表达随着组织学分级的升高和淋巴结转移的出现显著下降(P<0.05)。Livin和Bcl-2蛋白在乳腺癌组织中的表达显著相关(P<0.05)。结论 Livin基因在乳腺癌组织中表达上调，且与病理分期有关，提示其可能在乳腺癌发生、发展中起重要促进作用，Livin可能成为乳腺癌治疗中的一个靶基因，Livin与Bcl-2基因可能在乳腺癌的演进中起着协同作用。

　　【关键词】 Livin Bcl-2 免疫组化 乳腺癌

　　Expression and Significance of Livin and Bcl-2 Protein in Primary Breast CancerDONG Xin-qian，KONG Qing-ru，QI Feng-jie

　　(Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)【Abstract】 Objective To study the expressions in primary breast carcinomas，clinic significance of Livin and the relationship between it and Bcl-2 protein as well. Methods The expression of Livin and Bcl-2 protein was studied in 90 breast carcinoma samples, 30 breast benign lesion samples as well as 15 adjacent normal tissues by SP immunohistochemical (IHC) analysis. Results The positive rates for Livin and Bcl-2 protein expression were 67.8% (61/90) and 65.6% (59/90) respectively in breast cancer tissues, and there was obvious difference when compared with cancer adjacent normal tissues and breast benign lesions. The expression of Livin protein in breast cancer had nothing to do with tumor size, histologic type, histologic grade and lymph-node metastasis of Livin protein (P>0.05), but rose with the increase of clinical grade of the cancer (P<0.05). And the expression of Bcl-2 protein decreased sharply with histologic grade and lymph-node metastasis in breast cancer (P<0.05). The protein expressions of Livin and Bcl-2 were correlated with one another (P<0.05) closely. Conclusions The over-expression of Livin gene in breast cancer tissues was coupled with pathological grade, which indicated it may play an important role in carcinogenesis and progression of breast cancer, and it should be a target gene in therapy of breast cancer. Livin and Bcl-2 may play synergetic roles in the process of carcinogenesis of breast carcinomas.

　　【Key words】 Livin; Bcl-2; IHC; breast carcinomas

　　凋亡蛋白抑制因子(inhibitors of apoptosis protein, IAPs)广泛存在于许多物种中，起着抑制细胞凋亡的作用，其过度表达引起的细胞凋亡受阻与肿瘤发生关系密切。Livin蛋白是IAPs家族成员之一，在多种恶性肿瘤细胞和转化细胞中高表达，而在正常终末分化组织中很少或不表达[1] 。本研究采用免疫组化SP法检测乳腺癌中凋亡抑制基因Livin蛋白的表达，并探讨其与Bcl-2蛋白的关系，以阐明Livin蛋白在乳腺癌发生发展中的可能作用及临床意义，为乳腺癌的发生发展研究及靶向治疗提供一定的理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 组织样本 135例乳腺组织取自辽宁医学院附属第一医院外科2006年7月至2007年7月间手术切除标本。所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片，行HE及免疫组化检测。患者均为女性，年龄为14～77岁，中位年龄46岁，术前均未进行放、化疗及免疫治疗。所有病例均由两位以上病理医师确诊。依据2003年WHO乳腺癌分类标准进行组织学分类：非特殊性浸润性导管癌57例，浸润性小叶癌20例，浸润性特殊性乳腺癌13例;对浸润性非特殊性导管癌进行组织学分级：Ⅰ级19例，Ⅱ级24例，Ⅲ级14例。90例浸润性乳腺癌中50例有淋巴转移。根据国际抗癌协会TNM分期方案将乳腺癌分为：Ⅰ期42例，Ⅱ期36例，Ⅲ期12例。另取癌旁乳腺组织15例，乳腺良性病变30例作对照。

　　1.1.2 试剂 兔抗人Livin多克隆浓缩型抗体购自eBioscience公司，工作浓度为1∶100，兔抗人Bcl-2多克隆即用型抗体和浓缩型DAB显色液以及S-P染色试剂盒均购自福建迈新公司。

　　1.2 免疫组织化学SP法

　　石蜡切片脱蜡至水，柠檬酸缓冲液高压修复抗原，滴加一抗工作液，4℃过夜。顺次滴加生物素标记及辣根酶标记链酶卵白素，DAB显色，苏木素复染。设0.01mol/LPBS代替一抗作为阴性对照，以恶性黑色素瘤和淋巴结切片分别作为Livin和Bcl-2蛋白染色阳性对照。Livin蛋白定位于细胞浆和细胞核，Bcl-2蛋白定位于细胞浆和核膜，二者均以出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞，采用半定量计分法判定，连续观察10个高倍视野(×400)后评价结果，肿瘤细胞以染色强度计分×染色百分比计分，将0～4分定为阴性，4分以上定为阳性。

　　1.3 统计学分析

　　采用SPSS12.0统计软件进行统计分析，Livin蛋白和Bcl-2蛋白表达与临床病理参数间的关系采用χ2检验，Spearman相关分析二者的相关性。

　　2 结 果

　　2.1 Livin及Bcl-2蛋白在不同乳腺组织学中的表达

　　如表1所示，90例乳腺癌组织中，有61例Livin蛋白呈阳性表达，其阳性表达率高达67.8%;而对照的15例乳腺癌旁组织，仅1例(6.7%)蛋白阳性表达，乳腺良性病变的阳性表达率也仅为23.3%。Livin蛋白在乳腺癌组织中阳性表达显著高于乳腺癌旁组织及乳腺良性病变组织(P<0.05)。Bcl-2蛋白在乳腺癌旁组织及乳腺良性病变组织的阳性表达率分别为93.3%、86.7%，明显高于乳腺癌组织65.6%，差异有显著性(P<0.05)。表1 Livin与Bcl-2蛋白在乳腺不同组织学类型中的表达组别例数注：采用χ2分割法进行组间比较。●乳腺良性病变与乳腺癌组间比较，P<0.05;▲为乳腺癌旁组织与与乳腺癌组间比较，P<0.05

　　2.2 Livin和Bcl-2蛋白在乳腺癌中的表达与临床病理特征之间的关系

　　如表2所示，Livin蛋白在乳腺癌中的阳性表达与肿瘤大小，组织学类型，组织学分级及有无淋巴结转移无关(P>0.05)，但随着临床分期的增加而升高，经统计学处理，差异有显著性(P<0.05)。Bcl-2蛋白随着病理组织学分级的升高、淋巴结转移的出现，其阳性表达率显著下降(P<0.05)，但与其它临床病理参数无相关(P>0.05)。

　　2.3 Livin和Bcl-2在乳腺癌组织中表达的相关性分析

　　61例Livin蛋白阳性表达的乳腺癌组织中，Bcl-2蛋白的阳性表达率为75.4% (46/61);29例Livin蛋白阴性表达组织中，Bcl-2蛋白的阳性表达率为41.4%(12/29)，差异有显著性(P<0.05)。Spearman相关分析表明二者显著相关(r=0.332，P<0.05) (表3)。表2 乳腺癌组织中Livin及Bcl-2蛋白阳性表达与临床病理特征之间关系临床病理参数例表3 Livin与Bcl-2蛋白在乳腺癌

　　3 讨 论

　　Livin是新近发现的IAPs家族的新成员，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子之一，其表达具有细胞周期依赖性和明显的组织选择性。该因子主要通过直接抑制cpp32(caspase-3)的活化来阻断死亡受体及以线粒体为基础的凋亡途径[2]。Vucic[3]等将Livin基因转染乳腺癌MCF-7细胞，转染细胞对Fas，TNFR1( tumor necrosis factor receptor 1 )，DR4( death receptor 4 )及DR5介导的细胞凋亡具有显著的抑制作用。以往研究发现浅表性膀胱癌、神经母细胞瘤及直肠癌等恶性肿瘤中均发现Livin蛋白高表达，但Livin蛋白在乳腺肿瘤组织中的表达罕见报道。本研究采用免疫组化SP方法检测不同乳腺组织中Livin蛋白的表达，结果显示Livin蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达(67.8%)显著高于乳腺癌旁组织(6.7%)及良性病变组织(23.3%，P<0.05)，提示Livin蛋白表达上调可能在促进乳腺细胞异常增殖和恶性转化中起着重要作用，且有望成为乳腺癌基因治疗的新靶点。分析Livin蛋白与乳腺癌临床病理特征的关系发现，随着乳腺癌临床病理分期的增加，Livin蛋白的表达亦显著升高(P<0.05)，而与肿瘤的直径、病理分级及有无淋巴结转移无关(P>0.05)，提示Livin蛋白的持续表达可能进一步参与乳腺癌的恶性演进过程，而且极有可能成为反映乳腺癌恶性程度的参考指标之一，但尚需我们扩大样本，进一步研究证实。另外研究发现Livin蛋白在浸润性导管癌和浸润性小叶癌中的表达差异无显著性，说明在临床工作中Livin蛋白不能作为区分乳腺癌组织学类型的有用的生物学标记物。

　　Bcl-2是最早被认识的抗凋亡基因，该因子可以抵抗和抑制多种因素诱导的细胞凋亡，并在不影响细胞增殖的情况下增强细胞存活力，参与细胞增殖与凋亡动态平衡的调控[4]。Vucic等[3]1359-1366研究表明Livin蛋白的BIR结构域可与Smac蛋白(second mitochondria derived activator of caspases)结合，抑制其活性，促进细胞凋亡，而Bcl-2通过维持线粒体完整性阻止Smac的释放，使Livin蛋白发挥抗细胞凋亡的作用。本实验研究结果显示，90例乳腺癌中Livin和Bcl-2蛋白同时阳性表达为46例，占总数的51.1%(46/90)，同时阴性表达为17例，占总数的18.9%(17/90)，相关性分析得出乳腺癌中两者的蛋白表达有显著的相关性(γ=0.332，P<0.05)，提示两者可能起协同作用，共同抑制乳腺癌细胞的凋亡，从而促进乳腺癌的发生和发展。

　　研究发现，Bcl-2蛋白在乳腺癌中的表达(65.6%)显著低于乳腺癌旁组织(86.7%)及良性病变组织(93.3%)(P<0.05)，乳腺癌中，Bcl-2蛋白随着组织学分级的增高和淋巴结转移的出现，阳性表达率显著下降 (P<0.05)，说明Bcl-2蛋白的低表达与肿瘤的分化程度密切相关，Bcl-2可作为判断预后的参考指标之一，这一观点与Bosari等[5]的研究结果相一致。

　　综上所述，Livin蛋白在乳腺癌中呈高表达，其阳性率为67.8%，与临床分期密切相关;Livin和Bcl-2蛋白在乳腺癌中的表达显著相关，提示Livin和Bcl-2蛋白在乳腺癌发生发展中可能起协同作用，Livin蛋白有望成为乳腺癌基因治疗的新靶点。

　　【参考文献】

　　[1] Ashhab Y,Alian A,Polliack A,et al.Two splicing variants of a new inhibitior of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern [J]. FEBS Lett,2001,495(1-2):56-60.

　　[2] Kasof GM,Gomes BC.Livin,a novel inhibitor of apoptosis protein family member [J]. Biol Chem, 2001,276(5):3238-3246.

　　[3] Vucic D,Stennicke HR,Pisabarro MT,et al.ML-IAP,a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas [J]. Curr Biol,2000,10(21):1359-1366.

　　[4] Regine D,Wolfgang F,Gunther E.Telomere and telomerase:biological and clinical importance [J]. Clin Chem,1977,43(5):708-714.

　　[5] Bosari S,Moneghini I,Graziani D,et al.Bcl-2 oncoprotein in clolrectal hyperplastic polyps,adenomas and adenocarcinoma [J].Hum Pathol,1995,26(5):534-541.