FHIT基因在宫颈CIN及鳞癌中的表达及其与HPV16/18感染的关系

　　【摘要】 目的 研究16、18型人乳头瘤病毒(HPV16/18)DNA与脆性组氨酸三联体(FHIT)基因在宫颈鳞癌和宫颈上皮内瘤变(CIN)中的表达情况，探讨其在宫颈癌变中的作用和意义。方法 采用原位杂交法检测HPV16/18在50例CIN和50例宫颈鳞癌中的感染情况，同时采用免疫组化S-P法检测FHIT基因的表达情况。结果 正常宫颈组织鳞状上皮、CINI、CINII、CINIII和宫颈癌组织中FHIT表达下调或缺失表达率分别为0%(0/15)、13.33%(2/15)、33.33%(5/15)、50%(10/20)、78%(39/50)，正常宫颈组织与宫颈癌之间、CIN与宫颈癌之间、低级别CIN(CINI)与高级别CIN(CINII、CINIII)之间比较，差异均有显著性(P<0.05);在高、中、低分化的浸润性宫颈癌中，FHIT表达下调或缺失表达率分别为61.53%(8/13)、73.68%(14/19)、94.44%(17/18)，P<0.05;FHIT表达与宫颈鳞癌的临床分期及有无淋巴结转移无关。HPV16/18DNA在CIN和宫颈鳞癌中的阳性表达率分别为40%(20/50)、60%(30/50)，均明显高于正常宫颈组0%(0/15)，P<0.05;宫颈癌中HPV16/18感染与FHIT表达呈明显正相关，P<0.05.结论 FHIT表达缺失、HPV16/18感染均与CIN和宫颈癌的发生密切相关，FHIT缺失可作为CIN有可能发展为浸润癌的有用指标，HPV16/18感染可能是宫颈癌中FHIT异常的原因。

　　【关键词】 FHIT基因 HPV16/18感染 宫颈上皮内瘤变 宫颈癌

　　Relationship Between Expression of FHIT Genes and HPV16/18

　　Infection in Cervical Squamous Cell Carcinoma and Cervical

　　Intraepithelial NeoplasiaWANG Bao，GAO Zhi-an，LI Chun-hong，KONG Qing-ru

　　(Department of Pathology，Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)【Abstract】 Objective To study the expression of human papilloma viruses 16 and 18 (HPV16/18) DNA and FHIT genes in cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and cervical carcinoma (CC) and investigate the role and significance of them. Methods Tumor samples were taken from 50 cases of CIN, and 50 cases of CC were processed by immunohistochemistry (SP) to determine the expression of FHIT genes ，by in situ hybridization to detect HPV16/18 infection. Results The rates for loss of expression of FHIT genes in the squamous epithelium of normal cervices, CINⅠ,CINⅡ,CINⅢ and invasive cervical squamous carcinoma were 0% (0/15), 13.33% (2/15), 33.33% (5/15), 50% (10/20), and 78% (39/50) respectively. The comparison between Normal Cervical Epithelium (NEC) and CC, the comparison between CIN and CC, the comparison between CIN I and CIN II, CIN III have statistic significance (P<0.05). Among the well differentiated, intermediately differentiated and poorly differentiated invasive cervical carcinoma, the rates for loss of expression of FHIT were 61.53 (8/13), 73.68% (14/19), and 94.44% (17/18) respectively (P<0.05). There was no significant difference between the loss of expression of FHIT and clinical stage，lymph node metastasis(P>0.05). There was a positive correlation between FHIT expression and HPV16/18 infection in cervical squamous carcinoma (P<0.05). Conclusions HPV16/18 infection and the FHIT-depletion are closely related with cervical carcinogenesis. The FHIT-depletion may be a clinically useful marker of CINs, more likely to progress to invasive disease. HPV16/18 infection may probably be the factor leading to altered FHIT expression.

　　【Key words】 FHIT gene;HPV;cervical intraepithelial neoplasia;cervical carcinoma

　　近年研究发现，人类乳头瘤病毒感染尤其是高危型(16、18)与CIN、宫颈癌发生关系密切。FHIT是近年来发现的一种抑癌基因，在调节细胞周期和细胞凋亡方面具有重要作用，其蛋白表达在宫颈癌发生发展中的作用及其与高危型HPV16/18感染的关系目前研究甚少。本实验采用原位杂交技术检测HPV16/18在宫颈鳞癌、CIN中的感染情况，同时应用免疫组化S-P法检测FHIT基因的表达情况，探讨二者在宫颈癌发生、发展中的作用，分析HPV16/18感染与FHIT蛋白表达的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 临床资料

　　研究标本取自辽宁医学院附属第一医院病理科、锦州市妇婴医院病理科2005年1月至2007年1月间门诊活检或住院手术病例共115例，包括15例正常宫颈组织、50例宫颈鳞癌、50例CIN。CIN组50例均为宫颈锥切或子宫全切标本，宫颈癌组50例为宫颈癌根治术后的标本，另取因子宫良性病变而行子宫全切的正常宫颈标本15例为对照，所有病例术前均未经化疗和放疗。所有HE切片均经病理专家复核。

　　1.2 原位杂交

　　HPV16/18原位杂交试剂盒为美国ZYMED公司产品(购自北京中山生物工程公司)。杂交方法：切片常规脱蜡;100%乙醇浸泡5min后空气干燥;胃酶37℃孵育30min;逐级酒精脱水后空气干燥;每张切片加20μL探针，盖上盖玻片;95℃变性5min; 37℃杂交10h;PBS缓冲液中浸泡10min，去掉盖玻片;除外阳性对照，每张切片加入5～6滴杂交洗液，37℃ 孵育15min;加入50μL辣根酶标记抗地高辛抗体37℃孵育30min;DAB显色;复染、脱水、透明、封片。阳性对照为试剂盒中对照模版DNA;阴性对照为正常宫颈组织。

　　1.3 免疫组化

　　FHIT蛋白采用免疫组化SP法检测，兔抗人FHIT多克隆抗体、S-P试剂盒均为美国ZYMED公司产品(购自北京中山生物工程公司)。染色步骤参照试剂盒说明书进行。PBS代替一抗作为阴性对照，以已知FHIT表达阳性的正常乳腺组织为阳性对照。

　　1.4 结果判定

　　FHIT基因表达产物定位于细胞核和细胞浆，主要位于细胞浆。采用Greenspan半定量法[1]对细胞染色强度及阳性细胞百分率进行评分，完全没有着色记作0分;染色强度弱着色为1分，中等着色为2分，强着色为3分;阳性细胞百分率<10%为1分，10%～50%为2分，>50%为3分。两者分值相乘得各例综合评分，小于等于3分判为FHIT低表达或缺失，大于3分判为表达阳性。HPV16/18原位杂交结果判定：细胞核内出现棕黄色颗粒为HPV16/18阳性。

　　1.5 统计学分析

　　采用SPSS 12.0统计软件。计数资料应用χ2检验，等级相关检验用Spearman 相关检验。

　　2 结 果

　　2.1 FHIT在正常宫颈组织、ClN、宫颈癌组织中的表达(图1～2)

　　15例正常宫颈上皮FHIT均呈现阳性表达(100%);15例CINI中，2例出现明显的阴性表达(13.33%);15例CINII中，5例出现阴性表达(33.33%);20例CINIII中，10例出现阴性表达(50%);50例浸润性宫颈癌中，有39例FHIT表达阴性(78.00%).随着宫颈病变程度的增加，FHIT表达的阴性率逐渐升高。宫颈癌组织中FHIT表达阴性率与正常宫颈上皮组、CIN组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);CIN组内比较，只有CINI与CINIII之间差异有显著性(见表1)。

　　2.2 HPV16/18DNA在正常宫颈组织、ClN、宫颈癌组织中的表达(图3～4)

　　HPV16/18DNA主要存在细胞核内，呈棕黄色颗粒。15例正常宫颈组织中未检测到HPV16/18感染;HPV16/18DNA在15例CINI标本中有4例阳性(26.67%);在15例CINⅡ标本中，有6例阳性(40%);在20例CINⅢ标本中，10例为HPV16/18DNA阳性(50%);50例浸润性宫颈癌标本中有30例HPV16/18DNA阳性(60%)。在各级别CIN和宫颈癌中，HPV16/18DNA的阳性率随着宫颈上皮病变程度的加重呈现增高的趋势,CIN组与正常宫颈组比较，宫颈癌组与正常宫颈组比较，CIN组与宫颈癌组比较，差异均有显著性(P<0.05)(见表1)。表1 FHIT、HPV16/18在不同宫颈组织中的表达组别nFHIT表达缺失正常缺失率注：采用χ2分割法进行组间比较。a正常宫颈组与CIN比较，P<0.05;b CIN与宫颈癌比较,P<0.05;c正常宫颈组与宫颈癌比较，P<0.05;*CIN I与CIN II比较，P>0.05;Δ CIN Ⅱ与CINⅢ比较，P>0.05;**CIN I与CIN III比较，P<0.05

　　2.2 宫颈癌的FHIT表达与临床病理参数的关系

　　在本研究中，FHIT表达与宫颈癌临床期别、有无淋巴结转移无明显相关性(P>0.05)，在高、中、低分化的浸润性宫颈癌中,FHIT蛋白表达下调或缺乏的发生率分别为61.53%(8/13)、73.68%(14/19)、94.44%(17/18)。低分化与高分化比较、低分化与中分化比较，差异有统计学意义，见表2。 表2 宫颈癌的FHIT表达与临床病理特征的关系因素例数FHIT表达

　　2.3 宫颈鳞癌中HPV16/18感染与FHIT蛋白表达的关系

　　宫颈鳞癌中30例HPV16/18DNA表达阳性的病例中有28例FHIT表达缺失，而20例HPV16/18DNA表达阴性的病例中有11例表达缺失，进行相关分析表明两者之间呈明显正相关( rs=0.453,P=0.001)。

　　3 讨 论

　　3.1 FHIT与CIN及宫颈癌的关系

　　FHIT是ohta等[2]于1996年发现的一种抑癌基因,大量研究发现FHIT基因的异常改变见于多种肿瘤及肿瘤细胞系，如肺癌、头颈部癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、宫颈癌等。

　　最近研究表明宫颈癌中常见FHIT基因异常，包括杂合性丢失、纯合性缺失和异常转录。Butler等[3]报道，从低级别CIN、高级别CIN到宫颈癌，FHIT的杂合性缺失率呈现逐渐增高的趋势。本研究结果显示：15例正常宫颈组织的鳞状上皮和腺上皮均有FHIT的强表达，不同级别CIN及宫颈癌中都存在一定比例的FHIT表达下调或缺失，而且这一比例随病变程度的升高而增加，本研究还发现在不同临床分期的宫颈癌之间，FHIT蛋白的表达没有差异，而CIN与宫颈癌的表达之间有显著的差异，提示FHIT的表达下调可能在CIN向宫颈癌的发展过程中起作用，而与癌变后的进展无关。目前由于缺乏能够反映CIN发展为宫颈癌可能性的形态学标准和分子标记物，对CIN，尤其是高级别CIN的处理，一直是临床棘手的问题，本研究结果显示，宫颈鳞癌组织中FHIT蛋白的阴性表达率较高，而CIN组织中也存在一定比例的FHIT基因表达阴性，提示FHIT基因的表达缺失，可能在宫颈鳞癌发病早期起重要作用，由此可见，在高级别CIN中，FHIT蛋白的丢失可作为一个判定其有可能发展为浸润癌的有用指标。

　　3.2 FHIT表达与HPV16/18感染的关系及二者在宫颈癌中的作用。

　　16、18型人乳头瘤病毒是宫颈癌发生的高危型乳头瘤病毒，Van Tine[4]应用原位杂交法检测HPV16/18型感染，证实该法的敏感性高,特异性强，且可从HPV感染层次来定性判断疾病的程度，随着宫颈病变程度加重，病毒感染带增宽。本研究采用原位杂交法检测HPV16/18型感染。HPV16/18阳性病毒颗粒染成棕黄色，位于细胞核，多位于宫颈上皮中表层细胞，底层细胞极少，分布由散在→灶性→整个上皮。HPV16/18DNA检出率随着宫颈病变程度的加重而增高，这与钱得英等[5]的报道一致。HPV16/18DNA在宫颈鳞癌中的阳性表达率明显高于正常宫颈组(P<0.05),同时实验发现CIN组HPV16/18DNA阳性表达率低于鳞癌组而明显高于正常宫颈组(P<0.05),提示高危型HPV16/18感染与CIN及宫颈癌的发生发展有着密切的关系.HPV16/18感染后,其病毒DNA整合到宿主细胞DNA中,整合导致数个病毒基因被破坏,只有E6、E7基因得以保留并转录。 E6、E7 可分别与p53蛋白、Rb蛋白相结合，降低其抑癌功能，导致宫颈上皮细胞的恶性增生[6], 此机制已得到多数学者的认可。FHIT基因与HPV之间是否存在某种关联而共同参与宫颈癌的发生?研究发现,在FHIT基因内靠近FRA3B脆性区的一个区域,有HPV16的整合位点[7]。HPV16进入细胞后，可以以整个DNA或E6、E7片段整合到此位点。整合导致FHIT基因突变，影响其蛋白表达，降低其抑癌功能。butler等[4,7]386，144-149研究发现，HPVI6阳性CIN及宫颈浸润癌病例中,65%存在FHIT基因的杂合性缺失(LOH)，而87%的FHIT蛋白表达减弱或缺失的病例为HPV16阳性，FHIT基因LOH及蛋白低表达均与致瘤型HPV感　染显著相关，提示FHIT基因改变与HPV感染很可能作为协同因子参与宫颈癌的发生。Yoshino等[8]的实验结果则与此相反,认为HPV感染和FHIT基因异常是参与宫颈癌发生的两个独立的致病因素。有关宫颈癌中HPV16/18感染与FHIT基因异常的关系及它们之间相互作用的机制和方式还需进一步研究。(此文图1-4见附页1)

　　【参考文献】

　　[1] Greenspan DL，Connolly DC，Wu R，et al. Loss of FHIT expression in cervical carcinoma cell lines and primary tumors[J].Cancer Res,1997,57∶4692-4697.

　　[2] Ohta M，Inoue H，Cotticelli MG，et al. The human FHIT gene,spanning the chromosome 3p14.2 fragile site and renal carcinoma-associated translocation breakpoint，is abnormal in digestive tract cancers[J].Cell,1996,84:587-597.

　　[3] Butler D，Collins C, Mabruk M,et al.Deletion of the FHIT gene in neoplastic and invasive cervical lesions is related to high-risk HPV infection but is independent of histopathological features[J].Pathol，2000,192:502-510.

　　[4] Van Tine BA, Knops J, Broker TR,et al .In situ analysis of the transcriptional activity of integrated viral DNA using pyramid FISH [J]. Dev Biol (Basel),2001,106:386.

　　[5] 钱得英，岑坚敏，王丁，等.高危型人乳头瘤病毒DNA检测与细胞学联合检查对子宫颈癌前病变筛查的研究[J].中华妇产科杂志，2006，41(1)：34-37.

　　[6] Regina B Park, Flliot J Androphy. Genetic analysis of high-risk E6 in EpisomalMaintence of human papillomavirus Genomes in primary human kertinocytes[J].Journal of Virology,2002,76(22)11359.

　　[7] Butler D, Collins C, Mabruk M,et al.Loss of Fhit expression as a potential marker of malignant progression in preinvasive squamous cervical cancer[J]. Gynecol Oncol, 2002,86(2):144-149.

　　[8] Yoshino K, EnomotoT,Nakamura T,et al.FHIT alterations in cancerous and non-cancerous cervical epithelium[J].J Cancer,2000,85:6-13.