葛根素对肾缺血/再灌注时肾小管上皮细胞cFos蛋白表达的影响

　　【关键词】 葛根素;缺血/再灌注;肾;cFos蛋白

　　摘要：目的　从细胞凋亡角度研究葛根素治疗肾缺血/再灌注损伤的机制。方法 用肾动脉钳夹法建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，治疗组于肾缺血/再灌注前应用葛根素30mg/kg静脉注射;采用原位末端标记法、免疫组织化学法检测缺血再灌注不同时间点肾小管上皮细胞凋亡及cFos蛋白表达的变化。结果 葛根素能减少细胞凋亡，下调cFos蛋白的表达。结论 葛根素对急性肾缺血/再灌注损伤具有保护作用，其机制与下调凋亡相关基因cFos的表达有关。

　　Effects of puerarin injection on cFos protein of renal tubule cells during ischemicreperfusion in kidneyFu Rongguo, Wang Zhongdong, Zhou Lin, Zhang Hongli, Ma Liqun, Zhang Xingying, Ma Xiaoqin(1. Department of Nephrology, Second Hospital of Xian jiaotong University, Xian 710004; 2. ICU of Kunlun Factory Hospital, Xian 710004, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the role of puerarin on acute renal ischemiareperfusion injury and its mechanism. Methods Acute renal ischemiareperfusion iniury rat model was established by placing the atraumatic vascular clamp in renal pedical for 30 minutes. Rats in puerarin group were given puerarin injection 30mg/kg before ischemia. Immunohistochemical methods were used to detect the changes of expression of cFos proteins; pathomorphological changes of renal ischemiareperfusion injury were alse observed, and the occurrence of apoptosis was detected by TUNEL method. Results The pathological changes mainly occurred in the tubular epithelial cells of rat kidneys.The apoptosis index increased in the kidneys of ischemiareperfusion group and puerarin group,and peaked at 48 h of reperfusion(P<0.01). cFos protein mainly expressed in renal distal convoluted tubules, but the expression of cFos in puerarin group was still less than that in the ischemiareperfusion group. In control group, apoptosis of renal tubule cells and cFos protein expression was little. Conclusion Chinese herb puerarin can protect kidney against ischemia after acute renal ischemiareperfusion injury, which may be associated with decreased cFos protein expression in rats.

　　KEY WORDS: puerarin; renal; ischemia/reperfusion injury; cFos

　　葛根素(puerarin)是从中药葛根中提取的有效成分之一，对脑、肝、心等发生的缺血再灌注损伤有保护作用[1，2]。我们的研究亦发现，葛根素对急性肾缺血/再灌注损伤有防治作用，其机制可能与其抗氧化损害及改善缺血后血浆TXA2PGI2平衡有关[3]，但尚未从分子基因角度进行研究。本实验采用急性肾缺血/再灌注大鼠模型，葛根素注射液静脉注射进行药物干预，观察用药前后肾小管上皮细胞凋亡和cFos蛋白表达的变化，从分子水平探讨葛根素防治肾缺血/再灌注损伤的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组

　　健康SD大鼠100只，雌雄不拘，体质量200～250g。随机分为3组：假手术对照组(n=30)、缺血再灌注组(n=30)、葛根素治疗组(n=30)，后两组根据再灌注时间又分为3、6、12、24、48h组，每组各6只。

　　1.2 肾模型建立

　　用20g/L的戊巴比妥钠(20mg/kg)复合异氟醚吸入麻醉,并经耳缘静脉用微量泵注入平衡盐液10mg/kg?h;无菌操作下分别给耳动脉插管测心率、血压，普鲁卡因局麻开腹，分离肾蒂，无创动脉钳夹闭30min后开放双侧肾动脉，观察肾脏颜色，确定血流恢复，于各时间点取标本。实验中用电热褥维持体温。葛根素组于肾动脉夹闭前10min静注葛根素注射液30mg/kg;缺血再灌注组缺血前1h给予等量生理盐水，后夹闭肾动脉，30min后及再灌注不同时间点取肾组织;假手术组只开腹，但不分离和夹闭肾动脉。

　　1.3 标本采集和组织切片制备

　　在肾缺血/再灌注后3、6、12、24、48h分别快速处死大鼠，分离双肾，置于10%(体积分数)甲醛溶液中固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明。常规石蜡包埋，连续切片，片厚4μm。

　　1.4 原位末端标记法(TUNEL)

　　原位细胞凋亡检测试剂盒(POD)购自德国Bockinger Mannheim公司，蛋白酶K为Sigma公司产品，按试剂盒说明书检测。结果判定标准：凋亡小体呈深蓝色颗粒状。随机计算10个20倍物镜视野中凋亡细胞平均数为凋亡指数[3]。

　　1.5 cFos免疫组织化学染色

　　石蜡切片脱蜡至水，3%(体积分数)H2O2灭活内源性酶5～10min，蒸馏水洗2min×3次;微波抗原修复，滴加抗原修复液，室温5～10min，蒸馏水洗2min×3次;滴加正常山羊血清，室温20min，甩去多余液体，不洗;滴加一抗(兔抗Fos蛋白)，37℃孵育2h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2min×3次;滴加生物素化二抗(羊抗兔IgG)，37℃孵育20min，PBS洗2min×3次;滴加链霉亲和素生物素酶复合物(SABC)液37℃孵育20min，PBS洗5min×4次;DAB避光显色20min，苏木素复染，脱水，透明，封片，光镜下观察。

　　1.6 　统计学方法

　　数据以均数±标准差(±s)表示，用SAS软件处理，用t检验比较各组之间差异。

　　2 结果

　　2.1 生理学参数比较

　　与假手术对照组相比，缺血/再灌注组及葛根素治疗组血压、心率略有降低，但无统计学差异。表1 各组生理参数变化(略)

　　2.2 肾小管上皮细胞凋亡的变化

　　与假手术对照组相比较，缺血再灌注组和葛根素治疗组小管上皮细胞发生明显凋亡，尤以近端小管上皮细胞为主(图1);

　　但葛根素治疗组凋亡细胞数在再灌注后3～48h明显减少(P<0.01，表2)。表2 肾缺血/再灌注后肾小管上皮细胞TUNEL细胞数目(略)

　　2.3 葛根素对cFos蛋白表达的影响

　　cFos的表达主要集中在肾脏的近曲小管，远曲小管表达较少，髓放线和肾小球几乎不表达。葛根素治疗组与缺血再灌注组相比较，cFos蛋白表达于再灌注3～12h下降，但无统计学差异(P>0.05)，24～48h下降明显(P<0.01，表3，图2)。表3 肾缺血/再灌注后不同时间肾小管上皮细胞cFos蛋白阳性表达的变化(略)

　　3 讨 论

　　急性肾小管坏死是临床常见重危疾病，是导致急性肾功能不全的主要因素。肾脏为高灌注器官，对缺血以及缺血再灌注均敏感，而急性缺血和肾脏低灌注是其常见原因，探索防治肾再灌注损伤的新途径非常必要。形态学、生化、药理学和基因等多角度研究证明肾缺血/再灌注损伤中存在细胞凋亡[4,5]。本实验用高度特异性的TUNEL法检测肾缺血/再灌注后肾小管上皮细胞凋亡病变，结果显示假手术组可见极少量凋亡细胞，缺血再灌注48h内未见有凋亡细胞高峰，但在此时间段内随缺血再灌注时间延长，凋亡细胞数亦增加。

　　细胞凋亡是多基因参与的细胞程序化死亡。即刻早期基因(ICE)中的cfos基因是一种转录调节因子，cfos的表达能阻断细胞内信号的转导而产生一些死亡因子，cfos表达增加，表明与凋亡相关的反应性或应激性增加，是对缺血再灌注损伤严重程度的应激反应 [6,7]。在正常情况下，cfos在细胞内表达极低。多种外界刺激(缺血、感染)可诱导cfos表达[8]。其产物cFos蛋白与cjun基因编码的Jun蛋白形成Fosjun异源二聚体，作用于DNA的特殊序列，调节相关基因的转录，发挥第三信使的作用[9]。同时Ca2+与凋亡相关基因的表达有密切关系[11,12]。细胞内液Ca2+大量积聚是凋亡的始动因素。本实验中缺血/再灌注3h，cFos蛋白的表达即达高峰，后逐渐下降，但无统计学意义。

　　有研究证明，葛根素具有抑制一氧化氮(NO)合成和抗超氧阴离子自由基的作用[10]，还可抑制细胞内钙积聚，改善缺血后血浆TXA2PGI2平衡[3]。葛根素组与缺血/再灌注组相比较，缺血再灌注后3～48h肾小管上皮细胞凋亡细胞数明显减少;缺血再灌注后24～48h cFos蛋白表达显著下降，提示葛根素的肾脏保护可能通过减少细胞凋亡及下调其相关基因cfos的表达来实现。

　　参考文献：

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　　基金项目：陕西省科技攻关资助项目(No. 2004K17G29)

　　作者简介：付荣国(1971)，女(汉族)，医学硕士，主治医师.