大鼠混合反流模型中COX2、PCNA、Cyclin D1的表达

　　摘要：目的 探讨环氧合酶2(COX2)、增殖细胞核抗原(PCNA)及细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)这3项指标在反流性食管炎的发生、发展及癌变过程中的变化情况。方法 健康SD大鼠54只，随机分为2组：反流模型组46只，正常对照组8只。分别观察反流模型组术后5、17、28、40周，正常对照组40周时食管黏膜的病理变化，检测COX2、PCNA、Cyclin D1的表达情况。结果 在反流性食管炎的发展过程中，COX2、PCNA、Cyclin D1从正常→反流性食管炎(RE)→Barrett食管(BE)→食管腺癌(EAC)的阳性表达率分别为0.0%、42.1%、73.7%、100.0%;0.0%、42.1%、63.2%、100.0%;12.5%、42.1%、63.2%、100.0%。COX2、PCNA、Cyclin D1的表达程度逐渐增强。RE、BE、EAC的表达明显高于正常对照(P<0.05)，RE与BE、EAC间有显著性差异(P<0.05)，BE和EAC间无统计学差异可能是EAC的例数较少。结论 在混合反流造成黏膜损伤形成RE的同时， COX2、PCNA和Cyclin D1的表达增强，并随病程的发展逐渐增强。说明COX2、PCNA和Cyclin D1基因的高表达参与了从RE→BE→EAC的发展过程，是BE、EAC发生、发展的早期分子事件。

　　【关键词】反流性食管炎(RE);Barrett食管(BE);食管腺癌(EAC);环氧合酶2(COX2);增殖细胞核抗原(PCNA);细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)

　　The expression of COX2, PCNA and Cyclin D1 in the model of reflux esophagitis

　　Wang Tao, Gong Jun, Chen Qian, Wang Jinhai

　　(1. Department of Gastroenterology, Second Hospital of Xian Jiaotong University, Xian 710004;2. Department of Tumor Radiotherapy, First Hospital of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: ObjectiveTo investigate the expression of COX2, PCNA and Cyclin D1 in the progress of reflux esophagitis. Methods A total of 54 SD rats were divided into two groups randomly model group were treated with esophagoduodenostomy; control group were normals. The lesions of esophageal mucosa were observed in the 5th, 17th, 28th, 40th week in model group and 40th week in control group, respectively. The changes of COX2, PCNA and Cyclin D1 were evaluated by immunoperoxidase staining in the progress of reflux esophagitis. Results The positive rates of COX2, PCNA and Cyclin D1 were 0.0%, 0.0% and 12.5% in normal respectively, and were 42.1%, 42.1% and 42.1% in RE respectively, 73.7%, 63.2% and 63.2% in BE, and 100.0%,100.0% and 100.0% in EAC, respectively. The expression of COX2, PCNA and Cyclin D1 increased gradually with the development of reflux esophagitis, and significant difference was found between RE, BE and EAC, no difference was found between BE and EAC. Conclusion In the progress of RE, COX2, PCNA and Cyclin D1 increased gradually.

　　KEY WORDS: reflux esophagitis; Barrett esophagus; esophageal adenocacinoma; COX2; PCNA; Cyclin D1

　　反流性食管炎(reflux esophagitis, RE)是一种常见的消化道疾病。近年来RE及其并发的 Barrett食管(Barrett esophagus, BE)、食管腺癌(esophageal adenocacinoma, EAC)的发病率有增高趋势。目前对RE发病机制的研究已经进入了分子水平。研究发现与其发生相关的因素有细胞的增殖、COX2的表达、生长因子、癌基因、分泌因子、细胞周期蛋白、粘连分子、非整倍体和其他基因异常等。我们以临床多见的混合反流为依据，选择大鼠混合反流模型为研究基础，对反流性食管炎的发生、发展及癌变过程进行长期动态观察，同时选择环氧合酶2(cyclooxygenase2, COX2)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)这3项指标进行动态检测，探讨它们在反流性食管炎的发生、发展及癌变过程中的变化情况。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　健康SD大鼠54只，体质量210～230g，雌雄各半，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。随机分为2组：反流模型组46只，正常对照组8只。

　　1.2 主要试剂

　　COX2免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司，PCNA、Cyclin D1免疫组化试剂盒为美国Neomarkers公司产品，购于晶美公司。

　　1.3 混合反流模型的制作及观察项目

　　模型制作参照文献[1]。 反流模型组分别于术后5、17、28、40周处死大鼠8～12只，正常对照组于40周时处死8只。将大鼠处死后，取其食管全长，纵型剖开，观察食管黏膜损伤情况，同时留取病变黏膜组织多块，40g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，观察各期的病理变化及检测COX2、 PCNA、Cyclin D1的表达情况。

　　1.4 免疫组化染色和阳性结果判定标准

　　对石蜡切片进行HE染色确定病理诊断，同时采用SP法进行免疫组化染色，操作步骤严格按说明书进行。COX2蛋白阳性染色为细胞浆呈棕黄色，阳性细胞主要位于表层上皮细胞，随着病变的加重，化生的腺上皮细胞和腺癌细胞也出现阳性染色。PCNA、Cyclin D1蛋白阳性染色为细胞核呈棕黄色，阳性细胞主要分布于基底细胞层，随着病变的加重，浅层上皮细胞、化生的腺上皮细胞和腺癌细胞也出现阳性染色。每张切片随机选取5个高倍视野，光镜下按阳性染色的细胞数和染色深浅分级。(-)：无阳性细胞或阳性细胞数<10%;(+)：阳性细胞数≥10%而<25%;()：阳性细胞数≥25%而<50%;()：阳性细胞数≥50%。

　　1.5 统计学处理

　　各组间表达阳性率和阳性表达程度差异用χ2检验和非参数秩和检验，P<0.05为有统计学差异。

　　2 结 果

　　2.1 组织学改变

　　反流模型组大鼠术中及术后共死亡6只，可供分析标本40例。正常对照组8例。反流模型组随时间的推移，食管黏膜出现不同的组织学改变：炎症、糜烂、溃疡、增生、Barrett食管和腺癌等。根据其组织学改变将其分为RE、BE和EAC。反流模型组5、17、28、40周共发生RE 19例，BE 19例，EAC 2例。

　　2.2 COX2、PCNA、Cyclin D1在各组中的表达情况

　　反流模型组COX2、PCNA和Cyclin D1的表达程度和阳性表达率明显高于正常对照组(P<0.05，图1～6)。在反流模型组中，随着病变从RE→BE→EAC的发展，COX2、PCNA和Cyclin D1的表达程度也逐渐增强。RE、BE、EAC中COX2的表达均明显高于正常组(P<0.05，表1)。 表1 COX2在各组中的表达情况(略)

　　3 讨 论

　　COX是花生四烯酸合成前列腺素(PGs)的关键限速酶。研究发现，哺乳动物的COX至少有COX1和COX2两种同工酶。多数学者认为COX2的过度表达与炎症及肿瘤特别是消化系统肿瘤的发生、发展有密切关系[2-4]。Kandll 等的研究提示COX2在BE发展过程中可能属于早期事件[5]。本实验的结果显示，COX2在正常食管组织中呈阴性表达，COX2在从正常→RE→BE→EAC的发展过程中表达逐渐增强。说明COX2的表达同病变的严重程度一致，COX2的高表达参与了RE→BE→EAC的发展过程。

　　PCNA是反映细胞增殖状态的良好标志物。PCNA是DNA聚合酶δ的辅助因子，是DNA合成所必须的，对调节DNA复制合成起重要作用。研究表明，PCNA的表达在BE和EAC中明显增加[6-8]。叶萍等报道在从正常食管→反流性食管炎→Barrett食管→食管腺癌的过程中，PCNA的阳性表达率分别为5%、40%、60%、83.3%[9]。本实验结果也显示，PCNA从正常→RE→BE→EAC的表达程度逐渐增强。可见在反流性食管炎的发展过程中，PCNA的表达强度与病变严重程度相符。PCNA作为评估细胞增殖状态的指标，反映了细胞的代谢和DNA、RNA的合成状态，其过度表达与恶性生物学行为相关[10]。

　　Cyclin D1基因是一类在细胞周期中含量呈周期性变化的细胞周期调节蛋白，是细胞周期素依赖性激酶(CDK)的正向调节因子，调节着细胞增殖、分化和死亡的过程。Cyclin D1的过度表达,可导致pRB蛋白的磷酸化修饰提前实现,加速细胞从G1期到S期的转变,并促进细胞DNA的复制过程。研究表明，BE患者Cyclin D1的表达阳性者进展为EAC的危险性增高[11]。临床研究表明，Cyclin D1在正常对照、RE、BE、EAC患者中的阳性表达率分别为12.0%，28.6%，45.0%、77.8%;BE和EAC与正常对照相比有统计学差异，EAC与BE相比亦有显著性差异[12]。本实验的结果也显示，Cyclin D1从正常→RE→BE→EAC的表达程度逐渐增强。可见Cyclin D1基因表达的改变，在RE的发展过程中可促进细胞DNA的复制过程及加快细胞增殖周期，与RE及其并发症BE、EAC相关。

　　总之，在混合反流造成黏膜损伤形成RE的同时， COX2、PCNA和Cyclin D1的表达增强，并随病程的发展逐渐增强。说明COX2、PCNA和Cyclin D1基因的高表达参与了从RE→BE→EAC的发展过程，是BE、EAC发生、发展的早期分子事件。

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　　[12]王雯，文晓东. 细胞增殖调控基因在食管反流病变中的表达及临床意义 [J]. 中华消化杂志, 2003, 23(2):117-118.

　　基金项目：卫生部临床学科重点项目(No.20012130)

　　通讯作者：龚均，Tel: (029)88083495

　　作者简介：汪涛(1967)，女(汉族)，博士/主治医师. 研究方向：消化系统肿瘤. Tel: (029)85323249; Email: wangtao@csco.org.cn