促凋亡蛋白Caspase3与白血病细胞耐药的相关性

　　【关键词】 雄黄,阿霉素,K562/AO2细胞株,Caspase3,细胞凋亡,多药耐药

　　摘要：目的 观察阿霉素(ADR)耐药的人慢性粒细胞白血病细胞株K562/AO2在ADR和雄黄作用下细胞活力、凋亡及加入Caspase3抑制剂前后Caspase3酶活性的变化，探讨促凋亡蛋白Caspase3与白血病细胞耐药的关系。方法 ①四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定药物作用下细胞株的细胞活力(A值);②DNA琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA断裂情况;③酶显色活性分析法(CAA)测定Caspase3活性水平的变化。结果 ①MTT法：K562/AO2 细胞的A值与雄黄呈时间、剂量依赖关系。②雄黄作用组有凋亡发生。③未加抑制剂组Caspase3活性明显升高(P<0.05)，对雄黄呈时间、剂量依赖关系，加入抑制剂后此关系消失，对ADR无此关系。结论 Caspase3酶活性水平的变化能显著影响药物诱导肿瘤细胞凋亡的能力，在肿瘤耐药的发生发展中起着重要的作用 。

　　Correlation between drug resistance of leukemic cells and Caspase3Zhao Xinhan, Tian Honggang, Quan Ping, Liu Shaanxi

　　(Department of Oncology, First Hospital of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To explore the relationship between drug resistance of leukemic cells and Caspase3, this study took adriamycin (ADR)resistant human chronic granulocytic leukemic cell strain K562/AO2 as research subject, observing the cell survival and the morphological change of cell apoptosis under the action of ADR and arsenic sulfide and the Caspase3 activity before and after putting in the Caspase3 inhibitor. Methods ① The 3(4,5dimethylthiazo2yl)2, 5diphenyltetrazolium bromide (MTT) method was used to determine the cell survival(A value) of K562/AO2 cell strain under the action of ADR and arsenic sulfide. ② DNA agarose gel electrophoresis was performed to observe the DNA cleavage of apoptotic cells. ③ The enzyme colorimetric activity assay (CAA) method was used to measure the change of the Caspase3 activity of K562/AO2 cell strain. Results ① The A value of K562/AO2 cells had a time and dosage dependent relation with arsenic sulfide. ② Apoptosis occurred in the K562/AO2 cell strain affected by arsenic sulfide. ③ Compared with the cell strains with the Caspase3 inhibitor added, the Caspase3 activity of those without the Caspase3 inhibitor increased remarkably (P<0.05). For the K562/AO2 cell strain without the Caspase3 inhibitor added, the activity of Caspase3 had a time and dosage dependent relation with arsenic sulfide; the cell strain with the inhibitor added did not have any time and dosage dependent relation with arsenic sulfide. For the K562/AO2 cell strain, the activity of Caspase3 did not have any time and dosage dependent relation with ADR no matter the Caspase3 inhibitor was added or not. Conclusion Its found that the change of the Caspase3 protein expression level is able to significantly change the ability of drugs inducing cell apoptosis, and it plays an important role in the occurrence and development of drugresistance of tumors.

　　KEY WORDS: realgar; adriamycin; K562/AO2 cell strain; caspase3; cell apoptosis; multidrug resistance

　　白血病细胞多药耐药(multidrug resistance, MDR)的产生是白血病复发、难治的根本原因[1,2]。细胞的凋亡作为大多数化疗药物抗肿瘤作用的机制之一，其障碍极有可能作为一种新的耐药途径参与多药耐药的形成[3-5]。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartatespecific proteinase3, Caspase3)，可诱导肿瘤细胞发生凋亡。我们从Caspase3这一诱发细胞凋亡的关键信号分子入手，以阿霉素(adriamycin, ADR)耐药的人慢性粒细胞白血病细胞株K562/AO2为研究对象，观察Caspase3的变化及其在白血病MDR中的分子机制。此机制的阐明，可为临床肿瘤耐药逆转提供新的分子靶点和途径，为新型靶向逆转药物的开发提供科学的理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要材料

　　四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)购自华美公司;Caspase3显色活性分析试剂盒购自Chemicon International Inc，-20℃保存，由5× 细胞裂解缓冲液、5×测定缓冲液、Caspase3 底物 (AcDEVD PNA)、Caspase3抑制剂(AcDEVDCHO)、戊糖核酸标准液组成;雄黄购自西安中药集团(产自湖南)，雄黄药液(0.84～0.86g/mL AS4S4，0.12～0.15g/mLAS2S2)由西安交通大学血液病研究中心制备，使用时以完全培养液稀释至所需浓度;ADR购自Farmitalia Milano Italy,10mg/支，实验时用生理盐水稀释至所需浓度。

　　1.2 细胞培养

　　ADR耐药的人慢性粒细胞白血病细胞株K562/AO2由中国医学科学院血液病研究所惠赠，悬浮培养在10%(体积分数)加热灭活胎牛血清的RPMI1640培养液中，培养条件为5%(体积分数)CO2，37℃，饱和湿度，3～5d换液一次。取对数生长期细胞，调浓度为1×106/mL，接种于培养瓶中，进行实验。

　　1.3 细胞分组

　　将对数生长期的K562/AO2 细胞株分为3组，即不加任何药物的对照组、不同浓度(0.15、0.30、0.60、1.2μmol/L)的雄黄组和不同浓度(0.25、0.50、1μmol/L)的ADR组。

　　1.4 MTT法

　　将雄黄和ADR作用的细胞对应接种于96孔板，每孔0.2mL，每种浓度设5个复孔。另将对照组也接种于96孔板，用培养液调每孔容积为0.8mL。将培养板置于培养箱内分别培养3、6、24、48h。将培养板从培养箱中取出，每孔加入新配制的1g/ L MTT50μL，混匀，继续培养4h后，离心5min(1000r/min)，弃上清，每孔加二甲基亚砜200μL，震荡10min后，用酶联免疫检测仪在490nm处测定A值以筛选出最佳药物作用时间及浓度。

　　1.5 DNA琼脂糖凝胶电泳

　　雄黄和ADR作用于K562/AO2 细胞株48h后，每一组取5×106个细胞用PBS液洗2遍。 离心弃上清，加入细胞裂解液100μL混匀，再加入无DNA酶的RNA酶200mg/L，置37℃水浴1h，再加入蛋白酶 K，50℃水浴3h，冷却后加入等体积的饱和苯酚/氯仿/异丙醇(25∶24∶1)的溶液, 12000r/min，离心15min。将上清液移入另一离心管中，氯仿/异丙醇(24∶1)溶液再抽提1次，在上清液中加入0.1mol/L醋酸钠和2倍体积冷乙醇，-20℃过夜后于-10℃ 12000r/min离心10min，弃上清液，并以体积分数为70%乙醇洗涤1 次，真空干燥,最后溶于20μL TE(10mmol/L的Tris酸和1mmol/L的乙二胺四乙酸的混合液)。 取20μL样品与2μL上样缓冲液混匀，18g/L琼脂糖凝胶电泳3～4h，电压2V/cm，紫外灯下照相并观察结果。

　　1.6 Caspase3酶活性的测定

　　按照Caspase3显色活性分析试剂盒的使用说明操作：将3组细胞分别作用3、6、24、48h。分别取不同药物、不同浓度及不同时间作用下的细胞1×106个，1500r/min离心10min。重悬细胞于200μL 5×细胞裂解缓冲液中，冰上放置10min。在微离心管中离心5min，取上清，放入试管内，放置冰上。取96孔板，分为实验组、对照组和加入Caspase3抑制剂组，3组均加入20μL 5×测定缓冲液，10μL Caspase3的底物。实验组分别加入不同药物、不同浓度及不同时间作用下的细胞20μL;对照组加入无药物作用的肿瘤细胞悬液20μL;抑制剂组分别加入不同药物、不同浓度及不同时间作用下的细胞20μL及Caspase3抑制剂20μL，每孔均用培养液调体积至100μL，每种浓度设3个复孔。于37℃下保存2h。用酶联免疫检测仪在405nm处测定A值。

　　1.7 统计学分析

　　结果均以(±s)表示，SPSS 11.5统计分析软件进行数据的t检验，P<0.05有显著性意义。

　　2 结 果

　　2.1 MTT法检测细胞活性

　　A值反映细胞实际存活数即细胞活力。结果表明，K562/AO2细胞株对雄黄呈时间、剂量依赖关系，对ADR不呈时间、剂量依赖关系。0.15μmol/L 雄黄和1.00μmol/L的ADR作用于K562/AO2 细胞株48h时后的A值最低。与ADR相比，雄黄作用的细胞株A值低，其组间有显著性差异(P<0.05)，且雄黄作用的细胞株与对照组有显著差异(P<0.05);而ADR作用的K562/AO2细胞株的A值与对照组无明显差异(P>0.05，表1、2)。表1 不同时间的雄黄和ADR作用于K562/AO2细胞株时的A值变化(略)表2 不同浓度的雄黄和ADR作用于K562/AO2细胞株48h后A值的变化(略)

　　2.2 电泳

　　雄黄和ADR作用于K562/AO2 细胞株48h后电泳结果表明：雄黄作用的K562/AO2细胞株均出现阶梯状条带;而ADR作用的K562/AO2细胞株与对照组均未出现明显的阶梯状条带(图1)。

　　2.3 Caspase3酶活性的测定

　　在研究中，采用A值反映Caspase3酶的活性，A值与Caspase3酶的活性成反比。在0.15μmol/L雄黄作用于K562/AO2细胞株48h组，未加Caspase3抑制剂的A值显著低于加入Caspase3抑制剂的A值(P<0.05)。1μmol/L ADR作用于K562/AO2细胞株及加入Caspase3抑制剂的K562/AO2 细胞株48h后两者A值无明显差异(图2)。结果显示，K562/AO2细胞株(加入Caspase3抑制剂)的A值对雄黄不呈剂量、时间依赖关系,但作用48h后，其A值降低，有统计学意义(P<0.05)(3h与48h相比其A值分别为0.2831±0.0034、0.2592±0.0037) 。对于K562/AO2细胞株无论加入Caspase3抑制剂与否，其A值对ADR均不呈时间、剂量依赖关系。

　　3 讨 论

　　Caspases 是一组天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶。该家族蛋白酶的级联活化是细胞凋亡程序的主要运行方式，但并不是所有的Caspases都是细胞凋亡所必须的[6,7]。根据其生物学功能，Caspases可划分为两个亚家族[8]，在其2个亚家族的十多个成员中，Caspase3被认为与凋亡关系最为密切[9]，它是细胞凋亡中的关键分子，激活的Caspase3能使许多与细胞结构、细胞周期及DNA修复等有关的蛋白或激酶失活[10,11]。正常情况下，Caspase3以无活性的Caspase3酶原(proCaspase3)形式存在于哺乳动物多种组织和细胞内。Caspase3介导的凋亡在人体多种类型细胞中普遍存在，其降解凋亡标志底物的活性最强。Caspase3可被该家族其他成员激活，引起多基因变化，使胞质、胞核及细胞骨架的重要蛋白质降解失活，可以说Caspase3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路[12,13]。

　　目前，关于Caspase3在耐药方面的研究较少，现有的资料表明Caspase3活性降低在耐药细胞的抗凋亡中具有重要作用。对人类宫颈癌耐药细胞的研究表明，耐药细胞中Caspase3的活性降低是其产生凋亡抗性的主要原因[14]。对高表达P糖蛋白(Pglucose protein, Pgp)的耐药细胞CEM和K562而言，细胞毒性药物及Fas诱导的Caspases依赖性的细胞死亡被抑制，用Pgp单抗MRK16抑制Pgp功能后，将导致药物或Fas介导的Caspase3活性的提高，从而使耐药细胞发生凋亡[15]。相对应的是，Caspases非依赖性细胞死亡，例如孔形成蛋白或NK细胞介导的细胞死亡，不受Pgp表达作用的影响[16]。Indanocine是一种被美国国家癌症研究所肿瘤治疗发展计划所确认的一种新的抗肿瘤药物，由Lorenzo M等进行的对7种多药耐药细胞的研究表明，indanocine对其中的3种耐药细胞MCF7/ADR、MESSA/DX5和HL60/ADR的结果提示，耐药细胞被药物作用8～24h后，Caspase3的活性、线粒体的膜势电位和DNA的断裂都出现了凋亡性的变化。

　　本实验的结果显示：①雄黄可明显抑制K562/AO2细胞的生长，其作用强度与药物浓度及作用时间呈依赖关系，而与ADR则无此关系。②DNA电泳来确认雄黄通过细胞凋亡途径诱导细胞死亡。③K562/AO2细胞株在加入Caspase3抑制剂后，Caspase3酶活性明显低于未加入Caspase3酶抑制剂。并且K562/AO2 细胞株(未加Caspase3抑制剂)的Caspase3酶活性对雄黄呈时间、剂量依赖关系,而加入Caspase3抑制剂后，此关系消失，仅在作用48h后Caspase3酶活性明显上升， 对于ADR作用的K562/AO2细胞株无论加Caspase3抑制剂与否均不呈时间、剂量依赖关系。上述结论表明在药物诱导细胞凋亡的过程中均有Caspase3的参与，未加Caspase3抑制剂的细胞株在药物刺激下早期即出现了Caspase3酶的活化，而加Caspase3抑制剂的细胞株较晚时(48h)才出现Caspase3的活化，显示当加入了Caspase3 抑制剂后，凋亡被抑制而延迟出现，Caspase3表达水平变化能显著改变肿瘤细胞株对药物的敏感性。Caspase3通过诱导细胞的凋亡而减少细胞对化疗药物的耐受，提示Caspase3 在肿瘤耐药的发生发展中可能起着关键的作用。

　　虽然尚不清楚Caspase3在细胞的耐药发生发展过程中是如何起作用的，但本研究提示用细胞凋亡的机制来解释细胞耐药可能更具有普遍性，从而可为临床肿瘤耐药逆转提供新的分子靶点和途径，为新型靶向逆转药物的开发提供科学的理论依据，为临床治疗提供一个新的方法和途径。临床上提醒我们检测肿瘤细胞中Caspase3水平以及各种化疗药物作用后Caspase3的表达变化将有助于预测其对化疗药的敏感性及预后。而且各种药物诱导细胞凋亡的作用强度和每一种细胞对化疗药的敏感性不一致，了解不同药物和各种药物不同浓度之间诱导细胞凋亡的差异有助于我们临床选择用药，设计更合理的化疗方案，并且有助于针对不同的病人实施个体化治疗，从而提高对肿瘤细胞的杀伤作用。因此，无论在白血病还是实体瘤，通过诱导肿瘤细胞的凋亡即逆转肿瘤细胞的耐药来提高化疗的疗效，可能是今后肿瘤化疗的一个发展方向。

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　　作者简介：赵新汉(1965)，男(汉族)，博士，副教授，硕士生导师，主要从事肿瘤的综合治疗和耐药的研究.