Ⅰ型胶原及NF

　　【关键词】 动脉粥样硬化,Ⅰ型胶原,NFκB

　　摘要：目的 探讨动脉粥样硬化(AS)时血脂成分的改变以及Ⅰ型胶原mRNA与其蛋白、NFκBmRNA与其蛋白在兔AS发生中的作用及其机制，为临床预防及治疗AS斑块提供新的理论依据。方法 采用HE、免疫组化及原位杂交法染色，光镜观察AS病变，并应用CMIAS真彩色医学图像分析系统分析;检测40只食饵性AS新西兰兔血脂成分的改变及血管壁的病理变化、Ⅰ型胶原mRNA与其蛋白、NFκBmRNA与其蛋白的表达情况。结果 实验兔15周时血胆固醇(TC)升高约43倍，血低密度脂蛋白(LDL)升高约37倍。主动脉内壁可见脂质条纹形成。主动脉AS病变Ⅰ型胶原、NFκB蛋白及Ⅰ型胶原mRNA、NFκBmRNA表达定量(A值)分别为0.27±0.02、0.19±0.01及0.30±0.03、0.35±0.03，显著高于对照组(0.08±0.01、0.09±0.01及0.11±0.01、0.10±0.09，P<0.05)。结论 AS时Ⅰ型胶原增多刺激NFκB的活性，可能参与了血管AS的形成。

　　Study on relationship between typeⅠcollagen, NFκB and atherosclerosis in rabbits

　　Zheng Jianjie, Ma Aiqun, Wang Hongyan, Bai Xiaojun, Bai Ling

　　(1. Department of Cardiosurgery; 2. Department of Cardiology; 3. Department of Pathology, First Hospital of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To study the serum lipid (TC, TG, LDLC) and the role of typeⅠcollagen, NFκB, typeⅠcollagen mRNA and NFκB mRNA levels and their mechanisms in the occurrence and progress of atherosclerosis in order to provide theoretical gist for its prevention. Methods Blood vessel wall pathological and the serum lipid changes,the expressions of typeⅠcollagen, NFκB, typeⅠcollagen mRNA and NFκB mRNA levels were observed in dietary induced atherosclerosis rabbit model by morphology study, immunohistochemistry, in situ hybridization technique and color image analyzer(CMAIS). Results The model of AS was established successfully after rabbits were fed with cholesterol, who developed the fatty streak lesion in the aortic intrawall. In the rabbit model, TC and LDL were respectively increased 43 times and 37 times and there were no difference in TG and body weight. Type I collagen, NFκB, type I collagen mRNA and NFκB mRNA were 0.27±0.02, 0.19±0.01 and 0.30±0.03, 0.35±0.03, respectively, which were higher than those of control group(0.08±0.01, 0.09±0.01 and 0.11±0.01, 0.10±0.09, respectively) (P<0.05). Conclusion We understand further that hyperlipidemia is one of the uppermost causes of AS and provide theoretical gist for preventing AS. In other words, elevation of type I collagen in atherosclerotic lesions can stimulate NFκB activity , which is one of the mechanisms causing AS.

　　KEY WORDS: atherosclerosis; typeⅠcollagen; NFκB; rabbits

　　动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种慢性特异性炎症。近年来它在全球的发病率越来越高，并且逐渐年轻化，严重威胁着人们的身体健康[1，2]。因此，有关其发生、发展机制及防治措施的研究一直是医学领域的重大课题[3]。AS病变时胶原增多，尤其是Ⅰ型胶原增多更为显著。在我们的前期研究中发现,Ⅰ型胶原能直接促使单核细胞形成泡沫细胞，说明Ⅰ型胶原在AS形成、发展中起着重要的作用，但Ⅰ型胶原致AS的分子机制并不清楚。我们进一步对Ⅰ型胶原mRNA及其蛋白、NFκmRNA及其蛋白与AS的关系进行研究，以探讨AS时细胞外基质(extracelluar cell matrix, ECM)的主要成分Ⅰ型胶原对NFκB调控的分子机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　高脂饲料(由第四军医大学动物中心提供)，其成分为：100g中含85g普通粉状饲料+10g蛋黄粉+5g猪油。

　　1.2 实验分组及AS动物模型复制

　　选择雄性新西兰大白兔40只，体质量2～3kg(由第四军医大学实验动物中心提供)。随机分为两组：对照组10只，正常饲料喂养;实验组30只，用高脂饲料喂养。首先所有兔均用普通饲料喂养1周，以后实验组每日用高脂饲料喂养，食量不限，每只兔每日能进食饲料约100～300g，自由饮水。每天观察动物精神状态、进食及大、小便情况。患病动物给予对症治疗，必要时剔除。每周称体质量，自开始喂养后每月处死1只以观察AS斑块形成情况。喂养15周，共23只完成最终实验。对照组则给予普通颗粒饲料喂养，共7只完成实验。于兔耳中动脉采血，3000r/min，离心15min，取血清储存于-40℃冰箱中待用。同时取主动脉全段。

　　1.3 病理学观察

　　主动脉用PBS冲洗3次，照相后置于40g/L(4%)多聚甲醛中固定，肉眼观察、测量并记录大体标本的情况;石蜡包埋组织，切片，HE染色，光镜下形态学观察并照相。

　　1.4 血脂及Ⅰ型胶原、NFκB的蛋白的免疫组化染色

　　血脂成分(TC、TG、LDL)检测应用南京建成生物公司提供的试剂盒。用免疫组化SP方法测定组织Ⅰ型胶原、NFκB的蛋白表达。免疫组化鼠抗人单克隆抗体：Ⅰ型胶原(COL1)、NFappaκB P65(F6)及SP试剂盒购自北京中山公司，一抗稀释度分别为Ⅰ型胶原1∶60，NFκappaB P65 1∶50。

　　1.5 mRNA原位杂交法检测AS斑块中Ⅰ型胶原及NFappaκB P65

　　采用Ⅰ型胶原、NFappaκB P65的寡核苷酸探针，经地高辛标记。针对人Ⅰ型胶原靶基因的mRNA序列为：①5′GGCCA CCGCC CTCCT GACGC ACGGC CAAGA3′;②5′TCTTC AGCTT CCTGC CCCAG CCACC TCAAG3′;③5′TGATG CCAAC GTGGT TCGTC ACCGT GACCT3′;针对人NFappaκB P65靶基因的mRNA序列为：①5′CACCA CAAG TCAA GGCT CACA GACC3′;②5′TCTGG AGCT CCTC GTGG GATG GATC3′;③5′AAGAC TTCTC CTCCA TTGCG GACAT GGACT3′。该序列和大鼠、小鼠有99%的同源性。适应于人、大鼠及小鼠。而兔与人的寡核苷酸序列基本同源。方法和步骤按原位杂交方法检测试剂盒Ⅰ型胶原及NFappaκB P65说明书操作步骤进行(武汉博士德生物工程有限公司)。

　　1.6 结果判定及定量测定

　　应用Nikon双目显微镜观察所有染色切片，免疫组织化学染色显示细胞浆或ECM染为淡黄棕黄色颗粒者为阳性标志;原位杂交法染色显示为蓝褐色深蓝色颗粒为阳性标志。Ⅰ型胶原蛋白阳性表达定位于ECM中;NFκB蛋白阳性表达定位于内皮细胞(endothelial cell, EC)、平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)和组织细胞胞浆内，其中NFκB尚见于少数细胞核中。免疫组化及原位杂交法染色的所有切片在同一条下应用CMIAS真彩色医学图像分析系统(空军总医院生物医学工程研究所、北京航空航天大学研制)测定A值。每张切片测定前图像分析系统自动进行吸光度定标。定标后于低倍镜下随机选取5个视野，40倍物镜下由体视分析系统测定A值的平均数。

　　1.7 统计学分析

　　实验数据均以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS10.0软件进行统计分析; Microsoft Excel软件作图。两组间比较用t检验，以P<0.05定为显著性检验水平。

　　2 结果

　　2.1　食饵性兔血脂成分改变及主动脉AS斑块的严重程度

　　①实验组与对照组相比，15周时血胆固醇(ETC)及低密度脂蛋白(ELDLC)均明显升高(表1)。②大体观察：正常对照组兔主动脉管腔内壁光滑，未发现粥样硬化病变;实验组主动脉内壁可见乳白色小的突起，即脂质条纹，且病变程度不同(图1)。③食饵性兔AS病理组织学的变化：对照组7只为正常兔主动脉组织，内膜由单层扁平内皮细胞及较薄的内皮下层和内弹性膜构成。实验组23只，其中2只可见单核细胞黏附在内皮细胞表面(Ⅰ期);5只病灶处内皮细胞下可见多少不等的泡沫细胞，泡沫细胞圆形，体积较大，胞浆内有较多的小空泡(Ⅱ期);7只病灶处有大量泡沫细胞聚集及少数平滑肌细胞，并可见粉染的无定形物质，为细胞外脂质和少量淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞(Ⅲ期)。6只病灶处内皮细胞下可见1～3层平滑肌细胞，其下方为粉染的无定形细胞外脂质(Ⅳ期);3只病灶处表层有胶原纤维、平滑肌细胞形成的纤维帽，纤维帽下方见粉染的无定形细胞外脂质及坏死物，其中可见胆固醇结晶及钙化。周边部见泡沫细胞和淋巴细胞(Ⅴ期)。表1 兔体质量及血脂成分的变化(略)

　　2.2 食饵性兔主动脉AS病变中Ⅰ型胶原及NFκB蛋白的表达见表2。表2 兔主动脉AS病变Ⅰ型胶原、NFκB蛋白表达定量(略)

　　结果显示：实验组的主动脉AS病变中Ⅰ型胶原及NFκB蛋白表达明显高于对照组(P<0.05)。说明Ⅰ型胶原、NFκB蛋白的表达与兔主动脉AS病变发生有密切的关系。对照组兔主动脉组织EC中Ⅰ型胶原、NFκB蛋白表达为少量淡黄色颗粒，而实验组兔主动脉AS病变的阳性颗粒较对照组明显增多，颜色加深，呈棕黄色(图2)。

　　2.3　兔主动脉AS病变中Ⅰ型胶原mRNA及NFκBmRNA的表达见表3。表3 兔主动脉AS病变Ⅰ型胶原mRNA及NFκBmRNA的表达(略)

　　结果显示：实验组Ⅰ型胶原mRNA及NFκBmRNA的表达较对照组明显增高，两组比较具有显著性差异(P<0.05 )。对照组Ⅰ型胶原mRNA及NFκBmRNA的表达为少量蓝色颗粒，主要分布于ECM中。实验组AS病变中Ⅰ型胶原mRNA及NFκBmRNA的阳性颗粒较对照组增多，呈深蓝色(图3)。说明Ⅰ型胶原mRNA及NFκBmRNA的表达与兔主动脉AS病变的发生有密切的关系。

　　3 讨 论

　　AS病灶的形成是一个慢性过程，复制AS动物模型对AS研究极为重要，经典的方法是通过复制高脂血症形成食饵性AS动物模型。近年来，随着基因工程的发展，对小鼠基因组成了解的比较清楚，与其他动物相比，人和小鼠基因相同处最多，用基因工程方法使小鼠基因发生突变，另外小鼠繁殖快、操作方便以及相对喂养费用低也是重要的原因。转基因及基因敲除小鼠已应用于实验研究AS[4]。

　　兔对高脂膳食敏感性高，容易造成高脂血症和AS斑块，不足的是脂质代谢与人类不同，病变的主要分布与人也不同，很难形成严重的AS病变。我们经过15周的高胆固醇饮食喂养，成功地造成兔AS形成。其病变主要集中在升主动脉、主动脉弓、降主动脉及胸主动脉，较严重的病变多在动脉分支开口处，如颈动脉及肋间动脉分叉处。但观察AS斑块病理形态学特征，很难发现有脆性斑块(大脂质核、薄纤维帽、病灶肩部炎性浸润)和晚期有合并症(出血、血栓形成、钙化)的病灶。这也是动物实验的局限性。另外，发现用高脂饮食饲养后，兔血TC明显升高，LDL亦升高。从大体标本及光镜下可见：动脉血管内膜表面脂纹、脂质斑点小、呈黄色，略高于内膜表面。突起的纤维脂质斑块高于内膜表面，呈椭圆形，与动脉的纵轴平行。纤维斑块的颜色呈黄色到白色不等，这主要取决于在特定的斑块内脂质与胶原的比例。这些脂纹主要是由充满脂质的巨噬细胞组成。Faggiotto[5]通过电子显微镜扫描识别其早期病变，即单核细胞黏附在完整EC的表面，然后单核细胞迁移至内膜并且转化成巨噬细胞，后者摄取脂质成为泡沫细胞。巨噬细胞死亡，释放脂质形成脂核。由EC及巨噬细胞释放生长因子刺激SMC生长及ECM的合成。这一过程，可能是AS形成的基本过程。

　　胶原蛋白是一种重要的血管ECM蛋白，它使血管保持稳定的结构和张力。对维持血管壁的完整性、粘弹性和通透性有重要作用。而在EC损伤后，它可明显促进血小板的聚集。正常人类动脉壁中的主要胶原亚型是Ⅰ型(70%～75%)和Ⅲ型(20%～25%)，Ⅳ型仅占1%～2%。AS时，胶原增加，尤其是Ⅰ型和Ⅲ型胶原明显增加。同时Ⅰ型胶原是构成AS病变(脂纹和斑块)的重要组成成分。我们分别采用原位杂交法及免疫组织化学法，对兔主动脉AS组织中的Ⅰ型胶原mRNA及其蛋白进行检测，发现AS时Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达明显增加，说明兔主动脉ASⅠ型胶原mRNA及其蛋白的合成、分泌及降解是一个动态平衡过程。任何因素刺激动脉壁SMC合成和分泌胶原蛋白速率超过降解，胶原蛋白就会在动脉壁内沉积下来，并参与AS的形成与发展。

　　国内有人研究发现[6,7]，将年轻人与老年人冠状动脉斑块进行形态学的比较，发现年轻人斑块内Ⅰ型和Ⅲ型胶原均增生，而大多数斑块以Ⅲ型胶原增生占优势，而老年人斑块则大多数以Ⅰ型胶原纤维增生为主，Ⅲ型胶原的比例明显减少，表明由年轻人斑块向老年人斑块进展时，Ⅲ型胶原增生减少，Ⅰ型胶原增生增多。这可能由于Ⅰ、Ⅲ型胶原在不同类型的斑块内其降解的速率不同，还与其细胞功能逐渐衰退或发生凋亡有关。本研究通过对实验组和对照组兔主动脉AS病变组织NFκBmRNA及其蛋白检测发现：实验组NFκBmRNA及其蛋白的表达显著高于对照组，说明NFκB在AS的发病中起重要作用。因此，进一步研究NFκB和AS的关系对于揭示AS的发病机制及防治具有重要意义。

　　NFκB为具有多向转录调节作用的蛋白质，与许多基因特别是免疫炎症相关基因(如各种细胞因子、趋化因子和黏附分子等)的转录调控密切相关，而这些因子又对相应细胞的活化、增殖、浸润、趋化和分泌功能起着直接的调控作用。Brand等[8]用电泳迁移率变动分析方法(EMSA)证实NFκB以活化形式存在于AS病变处，并且活化的NFκB水平在病变组织明显高于无病变组织。还有研究发现[9]，高血压、高血脂、高血糖和病毒感染在引起AS均有NFκB激活，AS病变处的血管单核细胞、EC和SMC存在NFκB，且比正常组织增高，提示NFκB在AS形成中起重要作用。Wilson等[10]利用激活NFκB的p65亚单位单克隆抗体对不稳定型心绞痛和稳定型心绞痛患者AS斑块取样进行免疫组织化学研究，结果显示激活的NFκB出现在AS斑块处，并且不稳定型心绞痛组中NFκB的活性明显高于稳定型心绞痛组。Breuss等[11]研究发现，球囊成形术可在损伤局部诱导NFκB激活，使得管腔缩小，其机制可能为诱导炎症反应和减少细胞凋亡。Ialenti等[12]用球囊损伤大鼠颈动脉内皮后，用抗氧化剂四氢吡咯二硫代氨基甲酸盐(PDTC)治疗2周，内膜增生明显减轻，NFκB DNA结合活性明显降低，提示阻止NFκB激活可抑制新生内膜形成。

　　参考文献：

　　[1]Skalen K, Gustafsson M, Rydberg EK, et al. Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis [J]. Nature, 2002, 417(6890): 750- 754.

　　[2]Pichler R,Berg J,Maschek W, et al.Proinflammatory parameters as CRP and IL6 do not discriminate between postPCI cardiac patients with and without exerciseinduced ischemia as indicated by T1201 myocardial scintigraphy [J]. Cardiovasc Pathol, 2004,13(6):299-305.

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　　[8]Brand K, Page S, Rogler G, et al. Activated transcription factor nuclear factorkappa B is present in the atherosclerotic lesion [J]. J Clin Invest, 1996,97 (7): 1715-1722.

　　[9]徐红新. 核因子κB与动脉粥样硬化 [J].中国动脉硬化杂志, 2001, 9(2):179-181.

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　　[11]Breuss JM, Cejna M, Bergmeister H, et al. Activation of nuclear faerorkappa B significantly contributes to lumen loss in a rabbit iliac artery balloon angioplasty model [J].Circulation, 2002, 105(5):633-638.

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　　通讯作者：马爱群，Email:Maaiqun@sohu.com

　　作者简介：郑建杰(1964)，男(汉族)，心血管外科，副教授，博士