益气化痰组方对小鼠机体功能的作用机制研究

　　【摘要】 目的 探讨益气化痰方对小鼠机体功能状况的作用及其机制。方法 50只小鼠随机分为对照组，低、中、高剂量组、急支糖浆组，每组10只，采用对比法，对小鼠进行氨中毒实验，观察其对急性损伤的耐受力、耐高温(55600C)、爬杆时间观察;采用烟熏致小鼠咳嗽，观察药物对小鼠镇咳作用;最后颈椎脱臼法处死，取小鼠胸腺与脾脏，称重并计算重量指数，观察药物对小鼠免疫力的影响。结果 益气化痰方可明显提高小鼠耐急性损伤能力(P<0.05);益气化痰方可以使小鼠对高温的耐受性显著增强，并可延长小鼠在高温下的生存时间(P<0.05);益气化痰方能延长因氨水导致小鼠咳嗽潜伏期，并减少小鼠的咳嗽次数(P<0.05)，具有明显的抗疲劳作用。高、中剂量组可提高小鼠的胸腺和脾脏指数(P<0.05)。结论 益气化痰方有良好镇咳、平喘作用，同时具有抗疲劳、抗损伤、增强机体免疫力、提高应激能力作用。

　　【关键词】 益气化痰方;抗急性损伤;镇咳;抗疲劳

　　【Abstract】 Objective To investigate the changing of functional status in mice after treated by invigorating Qi and dissolving phlegm prescription,and to explore its action mechanism.Methods The contrast method was used to carry out ammonia poisoning experiment in mice, and the mouse’s tolerance to acute injury, high temperature environment (55～600C) and the time of climbing pole were observed.The cough models of mice were established by smudging,then the mice were treated by Yiqihuatan prescription to observe the effect of relieving cough, lastly,all the mice were killed by cervical dislocated,and the thymus and spleen of mice were taken out to be weighed and to calculate the mass index to observe the effect of drugs on immunity of mice . Results The invigorating Qi and dissolving phlegm prescription could significantly improve the ability of mice to resist acute injury(P<0.05) and could prolong the time of antihigh temperature tolerance significantly, and could enhance and prolong the time of survival time in high temperature environment (P<0.05). The latency of cough caused by ammonia in mice could be prolonged after treated by Yiqihuatan prescription, and the times of mice cough could reduced significantly(P<0.05).The climbing pole time could be prolonged, with obvious antifatigue effect (P<0.05),which could also improve and increase the thymus and spleen index (P<0.05).Conclusion The Yiqihuatan prescription has good effects of relieving cough and antiasthma,with the effects of antifatigue,antiinjury,increasing immunity of organism and enhancing stressresponse ability.

　　【Key words】 Yiqihuatan prescription ; antiacute injury;relieving cough; antifatigue

　　慢性支气管炎辨证多为本虚标实，虚实夹杂，证型以气虚血瘀痰阻最为常见。本虚以气虚、气阴两虚、脾肾阳虚为主，标实则以痰、瘀、风、热为著。治疗要标本兼治，虚、痰、瘀等同调。课题组在常规方剂的基础上，总结出“益气化痰”有效方剂，体现了温肺化痰、宣肺降气、寒热并用的治疗大法，本研究从实验室的基础药理学角度，探讨益气化痰组方的作用机制，为进一步推广临床运用提供实验室依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 动物:购自北京动物中心昆明级SD健康小鼠50只(批号：SCXK京2009-2004)，体重(20±5)g，雌雄均可。

　　1.1.2 药品:益气化痰方是由党参，黄芪，陈皮，法半夏，茯苓，杏仁，白芥子，制南星，甘草九味中药组成，由华北煤炭医学院药理实验室成员自行煎制。煎药的方法是，将所需药材按配方称重配好，先用温水泡60 min。再将药材放入锅中，加水(每500克中药加100 ml水)打开电磁炉加热煮沸，煮沸后保温40 min(120℃)，然后对其进行过滤，将滤液装入瓶中待用。第2次加水煮药材(以水没过药材1～2 cm为宜)煮沸后保温40 min。收集滤液，装入瓶中共计8副药。

　　1.1.3 试剂及仪器:500 ml广口瓶，秒表，25%～28%浓氨水，动物实验手术器械，0.9%氯化钠溶液，恒温电烤箱，玻璃棒、温度计、铁笼、实验橱柜、电子天平、灌胃器、250 ml磨口瓶、1 ml注射器、试管数个等。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 动物分组及给药:小鼠50只，随机分成5组，10只/笼，即空白对照组，益气化痰方低、中、高剂量组，急支糖浆组，给药3 d，其剂量为(1)空白对照组：选用0.9%氯化钠溶液正常灌胃，剂量为每日每次0.1 ml/10 g体重;(2)低剂量组0.00357 g/ml/10 g体重(相当于人用量5倍);(3)中剂量组0.00713 g/ml/10 g体重(相当于人用量10倍);(4)高剂量组 0.01428 g/ml/10 g体重(相当于人用量20倍)。

　　1.2.2 具体实验方法

　　1.2.2.1 益气化痰组方对小鼠抗急性损伤能力的影响： 各组小鼠末次给药1 h后，依次单只装入500 ml 广口瓶中，然后将广口瓶倒立于装有浓氨水(3 ml)的试剂瓶(150 ml，其口径要求小于广口瓶的口径)上(中间用纱网隔开，防止小鼠进入试剂瓶中)，开始记录从此刻到小鼠死亡时间，为小鼠耐急性损伤时间。

　　1.2.2.2 益气化痰组方对小鼠免疫功能影响：末次给药1 h后，颈椎脱臼法处死，分别取胸腺，脾脏，称重记录，计算脏器重量指数(weight index ， WI)计算公式：脏器指数=脏器重量(mg)/ 体重(g)。

　　1.2.2.3 小鼠给药1 h后，放入点燃烟草的密闭箱柜内，开始计时，至观察到小鼠首次咳嗽(以昂首，收腹，张大口为观察指标)时停止计时，此段时间为咳嗽潜伏期。之后，记录2 min内小鼠咳嗽次数。

　　1.2.2.4 各组小鼠给药1 h后将单只小鼠装在小铁笼中，置入55～60℃烤箱中(充分供氧)，用秒表记录每只小鼠死亡的时间，作为小鼠耐高温的时间。

　　1.2.2.5 将小鼠头向上置于竖直悬空玻璃棒(长约25 cm直径约1 cm)上端，开始计时，致小鼠从玻璃棒上滑下，计时结束，该时间段为小鼠的爬杆时间。重复3次，取其平均值。

　　1.3 统计学分析 应用SPSS 12.0统计软件，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 益气化痰组方对小鼠耐急性损伤能力的影响

　　低、中、高剂量组中毒死亡时间与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，中剂量组与急支糖浆组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

　　2.2 益气化痰组方对小鼠机体免疫系统功能的影响

　　中、高剂量组胸腺和脾脏重量指数与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，中高剂量组上述指标与急支糖浆组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

　　2.3 益气化痰组方对小鼠咳嗽潜伏期与咳嗽次数的影响

　　低、中、高剂量组咳嗽潜伏期与咳嗽次数与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，上述3组与急支糖浆组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

　　2.4 益气化痰组方对小鼠耐高温能力的影响

　　与对照组相比，高剂量能显著延长小鼠耐高温时间，有明显统计学意义(P<0.01)。中、低剂量组对比差异有统计学意义(P<0.05)，并有明显剂量依赖性。高剂量组对耐高温时间与急支糖浆组相比，有明显统计学意义(P<0.01)。中、低剂量组对耐高温时间比急支糖浆组延长，有统计学意义(P<0.05)。见表1。表1 5组小鼠相关指标比较

　　3 讨论

　　3.1 表1显示

　　高、中、低剂量组小鼠存活时间明显高于与对照组，因此具有提高小鼠抗急性损伤作用。同时，中剂量组对抗急性损伤能力好于急支糖浆;但是高、中剂量组与急支糖浆对比无统计学意义。分析量效关系(dose effection relationship)，我们认为：由于本实验是中毒死亡时间测定，如果与临床广泛使用的急支糖浆对比，中剂量组应是最大有效量(maximal effect ，Emax)，低剂量属于最低有效量(minimal effective dose)，但高剂量可能对小鼠机体产生了一定的毒性反应，使小鼠死亡时间比中剂量组缩短，应属于该组方的中毒量(toxic dose)。氨气为刺激性气体，可降低呼吸道防御功能，破坏上皮细胞，引起黏膜充血水肿，伴单核细胞、浆液及黏液性炎性渗出，导致急性损伤;刺激黏膜下感受器使副交感神经功能亢进，气管平滑肌收缩，腺体和黏液分泌增多，气道阻力增加，阻塞气道;血液中氨通过血脑屏障，减弱三羧酸循环和ATP生成，大脑功能障碍，严重时昏迷死亡。同时渗透压增大，脑组织受损 [1]。组方中甘草抑制炎症组织中PGE2生成、织液渗出和炎细胞浸润，拮抗炎性介质组胺、5羟色胺等发挥抗炎作用;陈皮可对抗组胺引起的支气管平滑肌痉挛性收缩，其有效成分柠檬烯具有支气管扩张作用[2-4];同时甘草次酸使肾上腺皮质激素合成和分泌增加[5]。进一步激动β2受体，发挥强大舒张支气管作用。抑制肥大细胞释放组胺等过敏性物质。激动支气管黏膜血管α受体，使其收缩，降低毛细血管通透性，利于消除支气管黏膜水肿;减低氨刺激及进入血液氨量减轻对脑及中枢毒性[2]。苦杏仁苷被肠道微生物酶或苦杏仁苷酶水解，产生氢氰酸与苯甲醛，抑制黏膜外周副交感神经及中枢系统，减少氨刺激冲动传导、降低腺体分泌、减小气道阻力[5];组方中党参、甘草和陈皮等通过上调抗氧化酶表达活性，提高组织超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)水平而抵抗自由基损伤、减少脂质过氧化(LPO)含量，有明显抗氧化作用，避免有害物质对组织细胞结构和功能破坏，减少对机体损伤[5]。茯苓可增强肝脏奥古蛋白活性，清除氧自由基[5]。总之，益气化痰方各药协同作用提高机体对急性损伤的耐受力，药量以中剂量最佳。

　　3.2 表2显示

　　与对照组和急支糖浆组比较，中、高剂量组方可明显提高胸腺和脾脏重量指数，低剂量组效果虽有差别，但效果相当、无明显统计学差异。胸腺、脾是机体最大和最重要的外周免疫器官，伴随上述变化，机体免疫功能明显增强。组方中黄芪、陈皮和党参可促进细胞中蛋白质和核酸合成，促进T细胞表面分子表达而增强细胞增殖，促进T淋巴细胞转化作用，从而增强细胞免疫[5-6];党参多糖可提高抗体水平，刺激B细胞分化增殖转变为浆细胞功能[5];黄芪含有活性较强的多糖类、黄酮类、三萜皂苷等成分，能提高网状内皮系统、脾脏中巨噬细胞功能，使肺部巨噬细胞数量增加，提高机体非特异性免疫，同时促进免疫反应早期阶段T细胞、B细胞前体细胞增生，显著增加血浆中IgM、IgE;并增加IgGl和IgG3水平;黄芪皂苷甲促进小鼠非胸腺依赖区内B细胞和浆细胞大量形成，促进粗面内质网中大量抗体合成而增强机体体液免疫[6];使辅助型T细胞(Th)细胞数增加，提高辅助型T细胞/抑制型T细胞Ts(Th/Ts)比值，纠正T细胞分布紊乱状况，并增加T淋巴细胞表面IL2受体表达[7]。黄芪还可诱导内源性干扰素，可显著增加外周血T淋巴细胞亚群的数量和细胞免疫活性;其中的茯苓多糖可增强PEC细胞毒性作用，明显增加吞噬细胞吞噬率、吞噬指数及溶酶体功能，从而增加单核细胞系统吞噬功能[8]。因此，只有服用高、中剂量才可提高机体免疫系统功能。

　　3.3 由表3可以看出

　　组方可显著延长小鼠咳嗽潜伏期，减少咳嗽次数。其效果优于急支糖浆。但以中剂量治疗效果最佳。烟草烟雾中的有害物质损伤呼吸道黏膜，黏膜受炎症刺激而出现咳嗽。咳嗽反射反射弧包括：呼吸道神经末梢感受器;传入神经(迷走神经);延髓咳嗽中枢;传出神经(迷走神经传出纤维、喉上神经和脑神经)。益气化痰方中的甘草口服后能覆盖在发炎的咽部黏膜上，缓和炎性刺激而镇咳，同时甘草次酸胆碱盐作用于中枢，抑制延脑咳嗽中枢以镇咳[9]。苦杏仁苷在下消化道被肠道微生物酶分解或被杏仁本身所含苦杏仁酶分解，产生微量氢氰酸，抑制呼吸中枢，止咳、平喘效果[10]。因此甘草与杏仁协同起到镇咳效果。陈皮水提物和挥发油能对抗氯化乙酰胆碱、磷酸组胺引起的支气管平滑肌收缩痉挛，再加上甘草次酸钠具有抗炎、抗炎性介质引起的气道阻力增加而达到止咳效果[11]。琥珀酸作为半夏总游离有机酸的主要成分，具有止咳、平喘作用[12]。以上四药协同抑制痰、咳、喘，具有重大临床意义;但推荐使用中剂量治疗，高剂量可能会因为药物不良反应降低疗效。

　　3.4 由表4证实

　　与对照组和急支糖浆组相比，组方高、中、低剂量能显著延长小鼠耐高温时间，并具有明显剂量依赖性。应激反应是机体受到各种有害刺激后产生的一种非特异性紧张反应。而抗应激就是抵抗、减轻、加速消除应激的过程。益气化痰方中的黄芪能促进机体代谢、抗疲劳、促进血清和肝脏蛋白质的更新;另外党参可提高机体对有害刺激的抵抗能力。党参多糖可延长小鼠游泳时间、增强耐高温能力、增强去肾上腺小鼠耐缺氧能力。同时甘草可以激活下丘脑—垂体—肾上腺皮质(HPA)轴系统对抗应激刺激，而使机体蛋白质、碳水化合物、脂肪等分解代谢增强，合成代谢降低，糖皮质激素分泌增加，增强其抗应激的功能，故可以用来提高机体的抗应激能力，具有重要的临床意义。

　　3.5 由表5证实

　　组方可提高小鼠运动能力，有明显剂量依赖性;但不如急支糖浆显著。运动性疲劳的发生主因自由基攻击细胞膜及线粒体，影响膜流动性，造成离子和能量代谢紊乱，产生疲劳;而超氧化物歧化酶(SOD)可催化过氧阴离子发生歧化反应，抵抗自由基对机体的毒性作用。研究表明党参和黄芪多糖可显著上调SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)水平与活性，增强对氧自由基清除能力，保护细胞膜结构和功能完整性;党参总皂苷能够降低血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)水平，提高NO和高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)水平，具有调节血脂和抗氧化作用[12-14]，达到抗疲劳效果。但急支糖浆含有麻黄碱可直接激动α、β受体使血流重新分配，保证脑、肌肉等重要器官组织的血供，保证营养物质的及时补充，减轻机体疲劳感。机体这种体液—神经系统调节要比酶合成调节快，故急支糖浆要比益气化痰方具有更好的抗疲劳作用。

　　总之，益气化痰方有良好镇咳、平喘作用，同时可抗疲劳、抗损伤、增强机体免疫力和抗各种应激能力作用。

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