大黄素抑制食管癌EC_109细胞增殖的机制探讨

　　【摘要】 目的：探讨大黄素对人食管癌细胞株EC_109增殖和凋亡的影响，并初步探讨其作用机制。方法：不同浓度(00，25、50、100、200?μg/mL)大黄素作用食管癌细胞EC_109，应用噻唑蓝比色法检测大黄素对食管癌细胞增殖的影响;用Annexin V_FITC/碘化丙啶双染流式细胞术检测细胞凋亡情况;流式细胞术检测细胞内活性氧变化情况。结果：不同浓度大黄素可明显抑制EC_109细胞增殖，并且呈浓度_时间依赖性;在作用EC_109细胞2?h后，细胞内活性氧明显增加;12?h后可见细胞凋亡率分别为81%、156%、240%、365%。结论：大黄素能明显抑制EC_109细胞的增殖，通过诱导细胞内活性氧的产生引起食管癌细胞EC_109凋亡。

　　【关键词】 大黄素;食管癌;活性氧;凋亡

　　The Mechanism about the Inhibition Effects of Emodin on the Proliferation of

　　EC_109 Cell in Esophageal CancerLIU Mei_hong，JING Xu_bin，CAI Xian_bin,CHEN Su_zuan,CAI Ju_yu

　　(Department of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital，Shantou University Medical College， Shantou515041，China)

　　[Abstract]Objective： To investigate the effects of emodin on esophageal cancer cell line EC_109 apoptosis, and to explore its mechanism. Methods： EC_109 cells were treated with different concentrations(00，25,50,100,200 μg/mL)of emodin. MTT assay was used to evaluate the influence of emodin on cell proliferation. Annexin V_FITC and propidium iodide were used to stain EC_109 cells， and the flow cytometry was used to determine apoptosis after treatment of emodin. The flow cytometry was used to test intracellular reactive oxygen species levels. Results： Emodin obviously suppressed proliferation of EC_109 cells. The apoptosis ratio was 81%， 156%， 240% and 365% respectively when the concentration of emodin exposed was 25， 50， 100 and 200 μg/mL. The generation of reactive oxygen species in EC_109 cells treated with emodin for 2 hours was enhanced significantly. Conclusion：Emodin can induce apoptosis in EC_109 cells，and the generation of reactive oxygen species is an important event involved in the apoptotic pathway induced by emodin.

　　[Key Words]emodin, esophageal cancer, reactive oxygen specie, apoptosis

　　大黄素是中药大黄有效成分之一, 为单蒽核类1，8_二羟基蒽醌衍生物，其具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、护肝、免疫抑制及抑制拓扑异构酶II等多种生物学活性[1～3]。近年来，有学者在乳腺癌、肺癌等细胞上发现大黄素通过蛋白激酶C诱导肿瘤细胞凋亡[4]，我们的早期研究也发现，大黄素可诱导肝癌细胞凋亡及相关机制[5]。但目前大黄素对食管癌细胞是否有生长抑制作用及其机制尚未见报道。本实验通过研究大黄素对食管癌EC_109细胞的增殖和凋亡的影响，对理解大黄素诱导肿瘤细胞凋亡的机制有重要意义，为临床肿瘤化疗用药提供有益的探索。

　　1材料与方法

　　11主要药品和试剂

　　大黄素(纯度>98%)、噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司，美国);RPMI_1640培养基(Gibco公司，美国);胎牛血清(杭州四季青公司，中国);Annexin V_FITC/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物发展有限公司，中国);2′，7′_二氯荧光素双乙酸盐(DCFH_DA)(Sigma公司，美国)。

　　12药物配制

　　大黄素用DMSO配制成4?mg/mL(质量浓度)，在_20?℃冰箱保存。实验前用培养液稀释为25，50，100，200?μg/mL。

　　13细胞培养

　　人食管癌细胞系EC_109被培养在含体积分数10%的胎牛血清、100?u/mL青霉素和质量浓度100?μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，培养条件为37?℃、体积分数5%的CO2、饱和湿度。

　　14MTT法检测大黄素对EC_109细胞生长抑制作用的影响[6]

　　培养细胞长满单层后，用质量分数025%的胰蛋白酶消化并混悬于含10%胎牛血清的RPMI_1640培养液中，调整细胞数为6×104/mL，以每孔100?μL加入96孔培养板中，置于37?℃、5% CO2/体积分数95%空气的培养箱，24?h后加入不同浓度大黄素，并设对照组加入等量RPMI 1640(每组设5个复孔)，继续分别孵育12、24、48?h后，加入质量浓度5?mg/mL的MTT溶液20?μL，振荡后继续培养4?h，终止培养。吸去上清，加入150?μL DMSO，振荡溶解10?min。空白对照调零，用酶联免疫检测仪测定570?nm波长下各孔吸光度值(A值)，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1_加药组平均A值/对照组平均A值)×100%。

　　15Annexin V_FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡

　　在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。被荧光素FITC标记的Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，可通过与凋亡早期细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸相结合而作为检测早期凋亡的灵敏指标之一。将4×105 个对数生长期细胞接种在6孔培养板中，生长至90%融合时，用不同浓度大黄素处理12?h，胰蛋白酶消化，1?000?r/min离心5?min，冷PBS洗2次，按试剂盒说明用500?μL Binging Buffer重悬细胞，加入5?μL Annexin V_FITC 混匀后，加入5?μL PI，混匀，室温避光培养15?min上机检测, 检测细胞数为1×104个。激发波长488?nm，发射波长530?nm。Cellquest软件分析。

　　16流式细胞术检测细胞内活性氧

　　DCFH_DA是一种自身不发荧光的化合物，它能自由透过细胞膜，被胞内活性氧氧化为二氯荧光素(DCF)。DCF能发出很强的荧光，其强度可反映细胞内活性氧的总体生成水平。将4×105个对数生长期细胞接种于6孔培养板，生长至90%融合时，加入不同浓度的大黄素，2?h后细胞用胰蛋白酶消化，PBS洗2次，用FCM(BackmanEpicsXL公司，美国)检测细胞荧光强度，以未加药为对照组。在检测20?min前分别加入终浓度10?μmol/L的DCFH_DA置于37?℃孵育。激发波长488?nm，发射波长530?nm。

　　17统计学处理

　　用SPSS160统计软件进行数据分析。

　　2结果

　　21不同浓度大黄素对EC_109细胞增殖的抑制作用

　　不同浓度大黄素作用EC_109细胞12、24、48?h后，通过MTT分析，发现大黄素对EC_109细胞的生长有明显抑制作用，其抑制效应与大黄素剂量、时间有良好的相关关系(P<005，图1)。

　　22不同浓度大黄素作用于EC_109细胞后的形态学变化

　　不同浓度大黄素作用于EC_109细胞24?h后经倒置显微镜观察并摄像，与对照组比，发现随着药物浓度的增加，细胞出现明显的形态学变化：体积缩小变圆，细胞质固化，部份核碎裂，细胞裂解等(图2，封2)。

　　23不同浓度大黄素对EC_109细胞凋亡率的影响

　　用Annexin V_FITC/PI双染法有效检测细胞凋亡。不同浓度大黄素作用EC_109 12?h后，流式细胞仪检测分析，计算早期凋亡细胞百分率，与对照组比有统计学意义(P<005), 表明大黄素有诱导EC_109凋亡的作用，且具有浓度依赖性(图3)。

　　24细胞内活性氧检测结果

　　不同浓度大黄素分别作用于EC_109细胞2?h后，用流式细胞仪测得细胞内的荧光强度可以反映图3不同浓度大黄素作用12?h后 EC_109凋亡率变化相应的活性氧生成(图4，封2)。随着大黄素浓度的增加，荧光较强的细胞逐渐增加。与对照组比，25、50、100、200?μg/mL大黄素细胞内活性氧显著增加。

　　3讨论

　　大黄素与阿霉素、柔红霉素等抗癌药同属蒽醌类化合物,是大黄、虎杖、何首乌等多种中药的有效成分之一。业已证明，大黄素具有较强的抗肿瘤活性和诱导细胞凋亡的作用。它可通过激活p53、p21的表达，在体外有效抑制肝癌细胞HepG2的增殖并诱导其凋亡[7]。大黄素对肝癌细胞Mahlavu有抑制其凋亡的作用[5]。本实验首先利用MTT法观察到大黄素对EC_109细胞有明显的增殖抑制作用。同时用流式细胞仪检测大黄素作用后的细胞，发现凋亡率与对照组比有统计学意义(P<005)，说明大黄素具有诱导EC_109细胞凋亡的作用，且有浓度依赖性。由此可以判断大黄素对食管癌细胞生长抑制方式也是以凋亡方式为主。

　　研究表明，活性氧是细胞凋亡的早期信号，它可作用于线粒体，促使线粒体膜通透性改变、细胞色素c释放。它还能与Apaf_1、caspase_9前体、ATP/dATP形成凋亡体，然后召集并激活caspase_9、caspase_3，进而引发caspases级联反应，使DNA断裂，引起细胞凋亡[8]。另一方面,损伤的线粒体能产生更多活性氧,加速细胞凋亡[9]。我们的前期研究证实大黄素是通过诱导肝癌细胞内活性氧的产生进而启动一系列凋亡程序[5]。本实验利用流式细胞仪检测食管癌EC_109细胞内活性氧水平，发现在药物作用2?h内，食管癌细胞内的活性氧明显增加且在一定浓度范围内呈浓度依赖性，提示大黄素可能通过干扰细胞线粒体的功能而产生活性氧，引起细胞脂质过氧化、损伤DNA分子或调节细胞凋亡相关基因而抑制EC_109的增殖。

　　综上所述，大黄素通过诱导细胞内活性氧的产生，而抑制EC_109细胞的增殖，为临床应用大黄素治疗食管癌及其他恶性肿瘤提供了理论依据，也为进一步寻找更有效的治疗药物提供了新的思路。

　　【参考文献】

　　[1]HUANG H C, CHANG J H, TUNG S F, et al. Immunosuppressive effect of emodin, a free radical generator[J]. Eur J Pharmacol, 1992, 211(3): 359-364.

　　[2]ESHUN K, HE Q. Aloe vera: a valuable ingredient for the food, pharmaceutical and cosmetic industries——a review[J]. Crit Rev Food Sci Nutr, 2004, 44(2): 91-96.

　　[3]KUO Y C, SUN C M, OU J C , et al. A tumor cell growth inhibitor from polygonum hypoleucum Ohwi[J]. Life Sci, 1997, 61(23): 2335-2344.

　　[4]LEE H Z. Protein kinase C involvement in aloe_emodin_ and emodin_induced apoptosis in lung carcinoma cell[J]. Br J Pharmacol, 2001, 134(5): 1093-1103.

　　[5]JING X B, NOBORU U, CHENG J D,et al. Induction of apoptosis in hepatocellular carcinoma cell lines by emodin[J]. Jpn J Cancer Res, 2002, 93(8): 874-882.

　　[6]GERLIER D, THOMASSET N. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation[J]. J Immunol Methods, 1986, 94(1～2): 57-63.

　　[7]KUO P L, LIN T C, LIN C C,et al. The anti_proliferative activity of aloe_emodin is through P53_dependent apoptotic pathway in human hepatoma cell line[J]. Life Sci, 2002, 71(16): 1879-1892.

　　[8]DJAVAHERI M M, WIETZERBIN J, BESANCON F, et al. 2_Methoxyestradio linduces apoptosis in Ewing sarcoma cells through mitochondrial hydrogen peroxide production[J]. Oncogene,2003,22(17): 2558-2567.

　　[9]TURRENS J F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species[J]. J Physiol, 2003, 552(2): 335-344.