脯氨酸脱氢酶基因单核苷酸多态性与偏执型精神分裂症的关联研究

　　【摘要】 目的：探讨脯氨酸脱氢酶(PRODH)基因单核苷酸多态性(SNP)与偏执型精神分裂症的关系。方法：应用聚合酶链反应技术及聚丙烯酰胺凝胶芯片技术对中国广东潮汕地区汉族276例偏执型精神分裂症患者与100例正常对照者的PRODH基因4个(2026、1945、1766、1852)SNP位点进行基因型检测，并对分型结果进行测序鉴定。结果:联合统计发现，PRODH基因的4个位点的单倍型频数两组分布差异有统计学意义(P<005)。结论：PRODH基因多态性与偏执型精神分裂症存在关联，PRODH基因可能通过多个多态位点相互作用影响了偏执型精神分裂症的发病风险。

　　【关键词】 偏执型精神分裂症;脯氨酸脱氢酶基因;单核苷酸多态性

　　Association Study of Proline Dehydrogenase Gene Polymorphism and Paranoid

　　SchizophreniaKONG Fan_zhi1, HONG Xiao_hong1, WANG Chang_qing1, PENG Zhi_zhen2, CHENG Lu3, SUN Bei_li3

　　(1 Shantou University Mental Health Center, Shantou515063，China， 2 The Third Peoples Hospital of Zhongshan City, Zhongshan528451, China,3 Chien_Shiung Wu Laboratory, Southeast University, Nanjing210096, China)[Abstract]Objective： To investigate the association between the proline dehydrogenase(PRODH)gene polymorphisms and paranoid schizophrenia. Methods：　The single nucleotide polymorphisms(SNP)(2026，1945，1766 and 1852)of PRODH gene were detected by PCR and polyacrylamide gel microarray in 276 paranoid schizophrenia patients and 100 healthy controls. And the results were re_genotyped by DNA sequencing. Results：　There was significant difference in the haplotype of the 4 SNPs frequency between two groups. Conclusion：　PRODH gene may be associated with paranoid schizophrenia by the co_action of its polymorphisms.

　　[Key Words]paranoid schizophrenia, proline dehydrogenase gene, single nucleotide polymorphism精神分裂症是一种严重的精神疾病，全球患病率约为1%[1]。有报道其遗传度高达80%[2]，提示精神分裂症与遗传因素密切相关，但它属于多基因遗传病，其遗传机制尚不清楚。关联分析、全基因组扫描及连锁分析均表明第22号染色体可能存在精神分裂症的易感基因。有研究，22q11微缺失患者中精神分裂症及分裂情感障碍等精神疾病的发生率高达20%～30%[3]，脯氨酸脱氢酶(PRODH)基因恰好位于这一染色体区。研究报道，PRODH基因多态性与精神分裂症关联，但还没有一致性结论。本研究对广东潮汕地区276例偏执型精神分裂症患者和100例健康者进行PRODH基因4个(2026，1945，1766和1852)多态位点的分析，探讨该地区PRODH基因多态性与偏执型精神分裂症的关系。

　　1资料与方法

　　11临床资料①偏执型精神分裂症组(男性144例，女性132例。年龄14～47岁，平均(238±61)岁)均符合中国精神障碍分类与诊断标准第3版(CCMD_3)偏执型精神分裂症的诊断标准。②正常对照组(男性59例，女性41例。年龄17～43岁，平均(254±58)岁)均无精神障碍史或家族史。所有入组人员均来自广东潮汕地区，对本研究知情同意，精神分裂症患者由本人及监护人签署知情同意书。

　　12方法

　　121基因组DNA获取抽取所有入组人员的外周静脉血6?mL,采用上海生物技术工程有限公司基因组DNA抽提试剂盒抽提基因组DNA,紫外分光光度计检测DNA纯度。

　　122PCR扩增用Primer 50软件和SNP BLAST网络服务系统进行引物设计，普通引物由上海英俊生物公司合成，依次进行PCR扩增及条件优化。引物序列见表1。优化后每25?μL PCR反应体系为：10×PCR缓冲液:25?μL，25?mmoL/L MgCl2:10?μL(1852,1945)和12?μL(1766，2026),10?mmoL/L dNTPs:05?μL,20?μmoL/L上、下引物：05?μL,Taq DNA聚合酶:15?U，基因组DNA 50?ng,去离子灭菌水补齐至25?μL。PCR条件：95?℃ 5?min→(94?℃ 30?s→62/64?℃ 40?s→72?℃ 45?s)×35循环→72?℃ 5?min。第1期孔凡芝等.脯氨酸脱氢酶基因单核苷酸多态性与偏执型精神分裂症的关联研究表1引物序列、PCR产物长度、退火温度及探针序列

　　Table 1Sequences of primers and probes，length of PCR products，annealing temperature

　　基因SNPl(产物长度)/bp引物序列T(退火温度)/℃探针序列Cy3Cy5PRODH1766156PF:5′_GCACCGTACCCCATCGCACC_3′

　　PR:5′_GCCCTCAGTTCCTGGCTTCA_3′625′_ACCACCAGGTGTA_3′5′_ACCACCGGGTGTA_3′2026243PF5′_TGTGAGGATGGGGTTGGCTGCG_3′

　　PR:5′_GTGCCCTATGGCCCCGTGAT__3′645′_GAGGCTGAGGGTGT_3′5′_GAGGCTAAGGGTGT_3′1852209PF:5′_CCGGTGGTCAGCAGGATGCA_3′

　　PR:5′_GCCAGGCAGAGCCCATACCC_3′645′_GTCCCCGGTGCAG_3′5′_GTCCCCAGTGCAG_3′1945245PF:5′_AGGCAGGGCGATGGAAGAG_3′

　　PR:5′_CTGGTGCGATGGGGTACGGT_3′625′_ACAGCAACTGCCG_3′5′_ACAGCAGCTGCCG_3′注：粗体碱基为荧光标记的变异位点

　　123产物纯化每管PCR产物加入体积分数95%的冰乙醇195?μL，置于_20?℃冰箱保存;4?℃，13?000?r/min离心45?min，弃去上层乙醇，将离心管置于37?℃烘箱烘干后将PCR产物干粉置于_20?℃冰箱保存备用。

　　124探针设计分别为每个SNP位点设计13个碱基左右长度的探针，5′端标记Cy3、Cy5双色荧光，野生型标记为Cy3，变异型标记为Cy5。探针序列见表1。

　　125利用聚合酶链式反应_聚丙烯酰胺凝胶芯片技术检测每个个体相应位点的基因分型，并对分型结果进行相应样品抽样测序鉴定，具体见参考文献[4，5]。

　　13统计学处理

　　采用plink(v 104)统计软件对基因分型数据进行H_W平衡检验及关联分析[6]，并用Haploview软件进行基因连锁不平衡分析。

　　2结果

　　21H_W平衡法则吻合度检验

　　两组基因型的观察值和期望值均符合H_W平衡，说明样本具有群体代表性。

　　224个SNP位点基因型及等位基因频数两组间比较

　　单个位点基因型及等位基因频率两组间分布差异均无统计学意义(表2)。表2PRODH基因型和等位基因频数分布D′>045，提示PRODH基因4个SNP位点之间存在连锁不平衡(表3)[7]。

　　24多位点联合统计

　　SNP属于双态性遗传标记，在群体中，其杂合度和多态信息量均较低。为了提高杂合性，更有效地利用遗传学信息，有必要进行多位点分析，即单表3连锁不平衡统计表4PRODH基因多位点联合统计

　　3讨论

　　PRODH基因位于22q112第173?Mb位置，含15个外显子，长约238?kb。它编码PRODH，在大脑等多个组织表达，该酶是脯氨酸代谢转化为△1_吡咯啉_5_羟化物(P5C)的限速酶，P5C是合成大脑的重要神经递质谷氨酸和γ_氨基丁酸(GABA)的前体[8]。脯氨酸是蛋白质合成和谷氨酸合成的一种非必需氨基酸。研究报道，脯氨酸可能是谷氨酸能突触亚级结构的抑制性神经递质[9]。有报道，PRODH基因可能通过影响谷氨酸能神经突触功能，调节谷氨酸释放，从而参与精神分裂症的发病机制[10_11]。因此也成为精神分裂症备受瞩目的易感基因之一。有学者通过来自欧裔南非人群和美国人群的3个不同样本研究，发现PRODH基因的单倍型A_C_C(1766_1945_2026)与精神分裂症关联(P<001)，他们通过样本年龄特点推测PRODH基因多态性可能与精神分裂症早期发病有关[12_13]。随后又有较多研究支持了他们的结果[14_15]，另有学者对中国四川528例家系研究进一步报道SNP位点1852在精神分裂症患者中存在等位基因G过传递(P<005)[7],1945/1852的单体型T_A(P=0006)，1852_1766的单体型G_G与精神分裂症的关联具有统计学意义(P=002)[7]。但也有较多不一致的研究[16～18]，没有发现PRODH基因多态性与精神分裂症存在关联。因此，PRODH基因多态性与精神分裂症的关联研究还没有一致性结论。

　　精神分裂症作为一个复杂的症状综合征，其不同亚型在症状学和生物学上差异性均较大,异质性比较强。本研究选取精神分裂症的一个单一亚型——偏执型精神分裂症作为研究对象,主要分析其与PRODH基因4个多态位点的关联性，并进行多位点联合统计，目前还没有这方面的报道。研究结果提示，PRODH基因位点2026_1945_1766(_1852)存在连锁不平衡，说明这些位点可能位于同一个连锁不平衡区域之内，提示其单倍型C_T_G,C_T_G_G可能作为一个整体增加了精神分裂症的发病风险(P=005)，有趣的是，我们的研究结果提示偏执型精神分裂症的风险单倍型与前面报道并不一致[7, 13]，这可能与地区人种或疾病亚型的异质性有关。研究还发现上述位点的另一单倍型C_T_A_A的对照组频率明显高于患者组(P=001)，提示这一单倍型可能是偏执型分裂症的保护因子，这在以前也是没有报道过的。

　　本研究提示PRODH基因多态性与偏执型精神分裂症关联，潮汕地区偏执型精神分裂症患者中，PRODH基因可能通过不同的多态位点相互作用方式增加了偏执型精神分裂症的发病风险。本研究的局限性在于样本量相对较小，研究位点也较少，在此基础上进一步增加样本量，检测PRODH基因更多多态位点，并检测早期发病的偏执型精神分裂症患者的PRODH基因多态性，可能对探讨PRODH基因多态性与偏执型精神分裂症的关联性更有意义。

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