白藜芦醇对软脂酸钠诱导的肝细胞脂肪变性的影响

　　【摘要】 目的：研究白藜芦醇对软脂酸钠诱导的细胞内甘油三酯沉积的影响。方法：用软脂酸钠诱导法使HepG2细胞内甘油三酯沉积，建立细胞脂肪变性模型，将实验分为对照、白藜芦醇、高脂及高脂+白藜芦醇组，用油红O染色法定量检测各组细胞内甘油三酯的浓度。结果：02?mmoL软脂酸钠可引起明显的细胞内甘油三酯沉积(P<005)，而40?μmoL白藜芦醇则可抑制软脂酸钠的这一效应，使细胞内的脂质浓度几乎降至基线水平。结论：白藜芦醇可改善软脂酸钠诱导的肝细胞脂肪变性。

　　【关键词】 HepG2细胞;脂肪变性;软脂酸钠;白藜芦醇

　　Effect of Resveratrol on Steatosis in HepG2 Cells Induced by Sodium PalmitateWANG Guang_li1， 2，FU Yu_cai2，FENG Ya_qing2，ZHOU Xiao_hui1

　　(1 Department of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital，Shantou University Medical College，Shantou515041， China，2 Laboratory of Cell Senescence，Shantou University Medical College，Shantou515041，China)

　　[Abstract]Objective： To investigate the effect of resveratrol on triglyceride accumulation in HepG2 cells induced by sodium palmitate. Methods： The cell model of steatosis was established using sodium palmitate in HepG2 cells. The experiments were divided into control， resveratrol， high fat， high fat+resveratrol groups. The amount of triglyceride in HepG2 cells was quantitatively analyzed by oil red O staining method. Results： The sodium palmitate(02 mmoL)resul_ted in significantly steatosis in HepG2 cells， the resveratrol(40 μmoL)inhibited the effect of sodium palmitate， and reduced the fat amount nearly to the basal level. Conclusion： Resveratrol is able to ameliorate the excessive triglyceride accumulation in HepG2 cells induced by sodium palmitate.

　　[Key Words]HepG2 cell，steatosis，sodium palmitate，resveratrol

　　近几十年来，随着肥胖和糖尿病发病率的不断上升，与这两种疾病相伴随的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)也日渐引起人们的关注。NAFLD已成为晚期肝病和肝细胞癌的一个危险性因素。迄今为止，治疗NAFLD最有效的方法是能量限制(CR)。但这种方法对于大多数NAFLD患者是难以奏效的[1～3]。研究表明，白藜芦醇可以模仿CR的效应，降低如心脑血管、糖尿病、癌症、以及神经退行性变等疾病的危险性[4]。最近的一项在小鼠体内的研究发现，白藜芦醇可以保护肝脏免受高脂饮食引起的损伤，可明显减少肝脏内脂滴的沉积[5]。然而，在体外模型中研究白藜芦醇对肝细胞脂肪变性影响的报道仍较少。本研究用软脂酸钠诱导人肝癌HepG2细胞发生脂肪变性[6]，尔后观察白藜芦醇对细胞内甘油三酯浓度的影响。

　　1材料与方法

　　11主要试剂和细胞

　　DMEM培养基(GIBCO公司，美国);胎牛血清(Clark Bio公司，美国);四氮唑蓝(MTT)、油红O、胰酶(Bio Basic Inc公司，加拿大);白藜芦醇和软脂酸钠(Sigma公司，美国);牛血清白蛋白(BSA)和二甲基亚砜(DMSO)(上海生物工程技术服务有限公司，中国)。人肝癌HepG2细胞由本校分子生物学中心宋旭红老师馈赠。

　　12方法

　　121试剂配制将白藜芦醇溶于DMSO中，置于_20?℃冰箱中保存。使用前，用新鲜培养基将母液稀释至所需浓度，DMSO终质量浓度为01%。不含白藜芦醇组加入DMSO，使其终质量浓度为01%。将软脂酸钠溶解于BSA与Hanks平衡盐溶液(HBSS)的混合物中[7]，储存于_20?℃冰箱中。使用前，用新鲜培养基将储液稀释至所需浓度。不含软脂酸钠组加入与软脂酸钠组相同浓度的BSA/HBSS混合物。

　　122细胞培养HepG2细胞用高糖DMEM培养基培养，加入体积分数10%的胎牛血清，青霉素(100?u/mL)，链霉素(100?mg/mL)。细胞置于37?℃的CO2培养箱中培养，当细胞融合达75%时，用胰酶(含质量分数025%的胰酶和质量分数002%的EDTA)消化传代。

　　123细胞活力测定药物作用后，用四氮唑蓝比色分析法(MTT法)评估细胞活力。HepG2细胞接种于96孔板中，细胞密度1×104/孔。细胞贴壁后(至少6?h)，更换培养基，加入含不同浓度(005～050?mmol)软脂酸钠或白藜芦醇(200～2000?μmol)的新鲜培养基;细胞孵育24?h后，加入MTT再培养4?h。弃去培养基，每孔加入100?μL DMSO，用酶标仪测定洗脱液的吸光度值(570?nm)。每组设3个复孔，至少重复3次。

　　124油红O染色和细胞内脂质定量测定细胞接种于盖玻片上，不同组的药物作用24?h后，用体积分数4%的多聚甲醛固定细胞20?min。PBS洗涤3次后，常温下用油红O染色2?h。然后，用自来水洗玻片3次。苏木精对比染色数秒，再次水洗，直至玻片呈蓝色。镜下观察细胞形态，并拍照。定量测定细胞内脂质浓度时，油红O染色后，彻底洗净玻片上残留的染料。然后将玻片置于32?℃的孵育箱中，烘干玻片上的水分。每孔加入200?μL溶剂异丙醇，10?min后，将洗脱液移至EP管中。用分光光度计于510?nm处，测其吸光度值[8]。

　　13统计学处理

　　所得计量资料用±s表示，应用SPSS130软件，用配对、成组t检验进行统计学处理。

　　2结果

　　21软脂酸钠对细胞活力的影响

　　用不同浓度的软脂酸钠作用细胞24?h后，用MTT法测定细胞活力。细胞活力与软脂酸钠的浓度呈剂量依赖关系，随着软脂酸钠浓度的升高，细胞活力逐渐降低(图1) 。当03?mmol软脂酸钠作用于细胞时，其活力为829%，而04?mmol软脂酸的细胞活力为735%(P<005)。为了减少软脂酸钠对细胞的毒性，在后续实验中，我们用01～03?mmol软脂酸钠作用于细胞，观察细胞内脂质沉积状况。

　　22软脂酸钠诱导细胞内脂肪沉积

　　用01～03?mmol的软脂酸钠作用细胞24?h后，用油红O染色法定性与定量测定细胞内脂质。图2(封2)为脂质定性观察，软脂酸钠可以引起细胞内脂质堆积增加。图3为脂质定量测定曲线图，细胞内脂质浓度与软脂酸钠呈剂量依赖关系。当软脂酸钠的浓度≥02?mmol时，实验组细胞内脂质浓度与对照组比有统计学意义(P<005)。02?mmol是引起细胞内脂质显著增加的最小剂量浓度，这一浓度将作为建立脂肪变细胞模型的作用浓度。

　　23白藜芦醇对细胞活力的影响

　　用不同浓度的白藜芦醇作用HepG2细胞24?h后，用MTT法测定细胞活力。细胞活力呈剂量依赖型递减(图4)，当白藜芦醇浓度为50?μmol时，细胞活力为831%;浓度为100?μmol时，则为546%(P<005)。为了减少对细胞的毒性，我们选择40?μmol作为白藜芦醇的实验浓度，观察其对细胞脂质沉积的影响。

　　24白藜芦醇抑制细胞内脂质沉积

　　为了观察白藜芦醇对细胞脂质沉积的作用，我们将细胞分为对照、白藜芦醇、高脂、高脂+白藜芦醇组。细胞加入不同的培养基孵育24?h后，用油红O染色法定量测定不同组分细胞内的脂质浓度。与对照组比，高脂组的脂质浓度显著增加(P<005)。然而，高脂+白藜芦醇组脂质浓度几乎降至基线水平(图5)。这些结果表明，白藜芦醇可抑制软脂酸钠诱导的细胞内脂质的沉积。

　　3讨论

　　近年来，无论在发达国家，还是发展中国家，随着肥胖和2型糖尿病发病率的上升，与二者相伴随的NAFLD逐渐引起人们的注意。流行病学调查的数据表明，NAFLD的患病率，在肥胖人群中为740%，中度肥胖900%[1]。NAFLD已成为导致肝衰竭的最常见病因[2]。

　　不饱和脂肪酸(尤其是多不饱和脂肪酸)对肝脏有保护作用，而饱和脂肪酸对肝脏有毒性作用, 后者在NAFLD的发病机制中发挥重要作用[3， 9]。无论在正常人体内，还是NAFLD病人体内，软脂酸都是含量最多的一种饱和脂肪酸[6]。因此，我们用软脂酸钠诱导细胞发生脂肪变性，以便更好地模拟NAFLD状态。我们选择人肝癌HepG2细胞作为研究对象，通过软脂酸钠诱导肝细胞发生脂肪变性;观察白藜芦醇是否可以减少细胞内脂滴浓度。结果表明，02?mmoL的软脂酸钠可以明显增加细胞内脂滴浓度，与对照组之间有统计学意义;同时用02?mmoL的软脂酸钠和40?μmoL的白藜芦醇作用于细胞时，细胞内脂滴浓度接近于对照组水平。上述结果提示，白藜芦醇有明显抑制软脂酸钠诱导的甘油三酯沉积作用。

　　综上所述，我们在接近NAFLD病理状态的体外模型中，证实了白藜芦醇对肝细胞脂肪变性有改善作用，但具体的分子机制尚不清楚，还有待进一步研究。

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