微孔板神经元NMDA损伤模型的建立及药物神经保护作用评价

　　【摘要】 [目的]建立96微孔板神经元N甲基D门冬氨酸(NMDA)损伤模型，并评价NMDA受体拮抗剂氯胺酮和抗炎症药米诺环素(minocycline)对神经元NMDA损伤的保护作用。[方法]用96微孔板原代培养的新生大鼠神经元体外培养至第10天(DIV10)时，用不同浓度的NMDA处理不同时间，以形态学和MTT染色为指标观察神经元的损伤情况，并观察氯胺酮和米诺环素对50μmol/L NMDA处理3 h造成的皮层神经元急性损伤的作用。[结果]随着NMDA浓度的增加和作用时间的延长，其神经毒性增加。氯胺酮100、10、1μmol/L和minocycline 135、45 μmol/L预处理对50 μmol/L NMDA处理3 h造成的皮层神经元急性损伤有明显的保护作用(P<0.01)。[结论]96微孔板培养的原代神经元NMDA损伤模型可以用于评价药物对神经元损伤的保护作用。

　　【关键词】 神经元损伤;N甲基D门冬氨酸;神经保护作用

　　Development of Neuron Injury Induced by NMDA in Microplates for Evaluating Neuroprotective Effect of Drugs

　　Wang Yiqi

　　College of Pharmaceutical Sciences，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou(310053)，China

　　Abstract：[Aim] To develop neuron injury induced by NmethylDaspartate (NMDA) in 96well microplates and evaluate neuroprotective effects of NMDA receptor antagonist ketamine and an antiinflammatory drug minocycline.[Methods] 96well microplates were used for cortical neuronal cultures from newborn rats at 10 days in vitro (DIV10).NMDA was used to induce neuron injury at different concentrations in different treatment durations with neuron morphology and MTT staining as index.The protective effects of ketamine and an minocycline on insult induced by NMDA 50 μmol/L for 3 h were also observed.[Results] NMDA concentrationdependently injured the cultured neurons.Pretreatments with ketamine 100，10，1 μmol/L and minocycline 135，45 μmol/L obviously protected NMDA (50 μmol/L)induced cortical neuron damage (P<0.01).[Conclusion] Cultured primary neurons in 96well microplates can be used for evaluating neuroprotective effects of drugs in vitro.

　　Key words：neuron injury;NmethylDaspertate (NMDA);neuroprotective effect

　　脑缺血时中枢神经内氧气和营养供应不足，细胞合成ATP能力下降。ATP的下降，一方面可导致钠钙出细胞减少、膜去极化、谷氨酸大量释放;另一方面，谷氨酸重吸收减少，最终谷氨酸在细胞间隙大量积聚，激活突触后膜上的谷氨酸受体(主要是NMDA受体)，造成神经元兴奋毒性损伤[12]。本实验模拟脑缺血时NMDA受体过度激活的病理状态，建立96微孔板原代大鼠皮层神经元NMDA损伤模型，并在建立细胞水平脑损伤保护药物筛选模型的基础上，对有明确神经细胞保护作用的NMDA受体拮抗剂氯胺酮以及近来报道可能有脑保护作用的抗生素米诺环素的作用[34]进行了评价。

　　1 材料和方法

　　1.1 试剂与动物 3(4，5二甲基噻唑2)2，5二苯基四氮唑溴盐[3(4，5dimethiazol2yl)2，5diphenyltetrazolium bromide，MTT] 购自上海实生生物技术有限公司。NMDA、胰酶(trypsin)、多聚赖氨酸(Lpolylysine)、阿糖胞苷(Cytosine Arabinoside，AraC)购自美国Sigma公司。DMEM高糖培养基、马血清、N2、B27购自Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。氯胺酮 (ketamine)购自上海第一生化药业有限公司，米诺环素 (minocycline) 购自日本昭和发酵工业株式会社。出生24 h内的♂和♀清洁级SD新生大鼠，由浙江省医学科学院动物中心提供(动物合格证号：2001001)。

　　1.2 大鼠皮层神经元原代培养 参照文献[5]，无菌条件下取新生大鼠大脑皮层，去除脑膜和血管，在冰冷解剖液中将皮层剪成1 mm左右的组织块，冲洗后将组织块置于0.25%胰酶(pH 7.4)溶液中，37℃消化20 min。吸去胰酶溶液，组织块用3 ml种植液(每100 ml含高糖DMEM 80 ml，胎牛血清10 ml，马血清10 ml，0.2 mol/L谷胺酰胺1 ml，青、链霉素各100 IU)冲洗2次，加2 ml种植液，用细口的吸管轻轻吹打10～15下，制成细胞悬液，将细胞悬液静置1～2 min，吸取上清入另一管，再加2 ml种植液，重复吹打步骤，合并上清。将上清用200目筛网过滤。取过滤所得的细胞，计数后用种植液稀释至1×106/ml接种于96培养板(每孔100 μl)。细胞在接种后d 1用饲养液(每100 ml含高糖DMEM 95 ml，马血清5 ml，0.2 mol/L谷胺酰胺1 ml，N210 μl，B27 40 μl，青、链霉素各100 IU)全量换液，然后每3 d或1周2次用饲养液半量换液直至使用。神经细胞种植后5～7 d，用3～5 μg/ml阿糖胞苷(ARAC)作用48 h，抑制胶质细胞的过度生长。

　　1.3 药物对神经元的作用 体外培养至d 10的神经元用10、25、50 μmol/L NMDA作用24 h;或用50 μmol/L NMDA作用3、6、9 h，观察NMDA的浓度及时间依赖性损伤作用。为观察药物对NMDA急性损伤的保护作用，米诺环素及氯胺酮与50 μmol/L NMDA共培养3 h。培养结束后，在倒置相差显微镜下观察细胞形态并摄影;或以0.5 mg/mL MTT在37℃染色2 h后，用二甲亚砜100 μl溶解结晶，振荡10 min，在酶标仪测定波长490 nm处测吸光值，用给药组OD值占对照组OD值的百分比反映细胞的活性。

　　1.4 统计方法 数据以x±s表示，用方差分析检验差异的显著性，以SPSS for Window 10.0进行统计处理。

　　2 结果

　　2.1 N甲基D门冬氨酸的浓度及时间依赖性损伤作用

　　2.1.1 皮层神经元在10，25，50 μmol/L NMDA持续作用24 h后，MTT试验吸光度呈剂量依赖性下降(P<0.01，表1)。

　　表1 不同浓度NMDA持续攻击24 h对原代培养皮层神经元MTT比色的影响(略)

　　与对照组比较** P<0.01,***P<0.001

　　2.1.2 50 μmol/L NMDA攻击3、6、9 h后，细胞活性显著下降，且NMDA作用时间越长，MTT吸光度下降越明显(P<0.01，表2)。

　　表2 NMDA (50 μmol/L) 不同时间攻击对原代培养皮层神经元MTT染色的影响(略)

　　与对照组比较,***P<0.001.

　　2.2 Minocycline、氯胺酮对NMDA诱导的大鼠皮层神经元损伤的保护作用

　　2.2.1 形态学观察：正常大鼠皮层神经元培养至10～12d时，生长良好，胞体透亮，立体感强，突起呈树根状交织成网状(图1 A)。NMDA 50 μmol/L作用3 h后，绝大多数细胞肿胀成空泡状，或完全崩解(图1 B)。氯胺酮、Minocycline 135 μmol/L和NMDA 50 μmol/L共作用3 h后，细胞损伤明显减轻，细胞膜和突起基本完整(图1 C、 D)。

　　Fig 1.Damage induced by NmethylDaspartate (NMDA) and effects of ketamine and minocycline in primary cortical neurons at 10 days in vitro. (略)

　　A: control;B: treated by 50 μmol ·L-1 NMDA for 3 h;C: treated by NMDA and 10 μmol ·L-1 ketamine;D: treated by NMDA and 45 μmol ·L-1 minocycline.Bar = 50 μm.

　　2.2.2 MTT试验：NMDA 50 μmol/L处理3 h后皮层神经元活性显著下降(P<0.001)，氯胺酮100、10、1 μmol/L及Minocycline 135、45 μmol/L对NMDA 50 μmol/L处理3 h诱导的急性损伤有明显保护作用(P<0.01，表3，表4)

　　表3 不同浓度氯胺酮对原代培养皮层神经元NMDA损伤后MTT比色的影响(略)

　　与对照组比较，*P<0.05，***P<0.001;与NMDA组比较，###P<0.001

　　表4 不同浓度Minocycline对原代培养皮层神经元NMDA作用后MTT比色的影响(略)

　　与对照组比较，***P<0.001;与NMDA组比较，##P<0.01，###P<0.001

　　3 讨论

　　为了建立细胞水平脑损伤保护药物高效率药效评价模型，我们采用96微孔板培养原代皮层神经元细胞。原代培养的皮层神经元能保持或接近在体神经元的电生理和突触功能，更能代表神经元的功能状况，用于脑损伤保护药物药效评价比传代的细胞更加可靠并更加接近生理状态。另外，采用96微孔板培养细胞，一次可以筛选多种药物或一种药物多个剂量，用简便的MTT染色(微孔板酶标检测仪测吸光度)和直观的形态学(倒置显微镜下直接观察并拍摄细胞的生长状况)作为指标，较传统的细胞药物筛选方法效率更高。

　　用NMDA攻击神经元，结果发现NMDA剂量越大、作用时间越长细胞活性下降越明显，与文献报道一致[6]。我们采用50 μmol/L作用3 h作为急性损伤的模型，并用氯胺酮作为阳性药，验证模型。氯胺酮是NMDA受体特异性阻断剂，对NMDA诱导的损伤有确定的保护作用，在本实验中，也证明了这一点，说明我们建立的NMDA损伤模型是确实可靠的。

　　在模型可靠的基础上我们还对最近报道有神经损伤保护作用的抗炎药minocycline作了药效评价[34]。Minocycline是一种半合成的第二代四环素类抗生素，可用于一些外周炎症的治疗。有文献报道该药对一些脑缺血损伤如兴奋毒性、神经退行性变以及一些退行性疾病如巴金森病、多发性硬化病等有保护作用[78]。本实验结果表明Minocycline 135、45 μmol/L对NMDA诱导的急性损伤也有明显的保护作用。但是我们报道的有效浓度比文献要高，推测可能是由于损伤模型的不同，保护的机制不同造成有效浓度的差异。NMDA诱导的急性损伤主要是由于钙超载、氧自由基和NO的过量生成，minocycline保护NMDA诱导的急性损伤的机制可能通过阻断氧自由基和NO的过量生成[9]。

　　总之，本实验建立了96微孔板神经损伤保护药效评价模型。该模型在96微孔板基础上以简便的MTT染色和直观的形态学为指标，较传统的细胞水平药效评价有更高的效率。此外，我们还用氯胺酮作为阳性药物，验证了模型的可靠性，并在模型基础上对抗炎药Minocycline的药效进行了评价，证明该药对NMDA诱导的神经元损伤有一定的保护作用。

　　【参考文献】

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　　[9] Lin S，Wei X，Xu Y，Yan C，et al.Minocycline blocks 6hydroxydopamineinduced neurotoxicity and free radical production in rat cerebellar granule neurons[J].Life Sci，2003，72(14):163541.