HPLC法测定新疆鼠尾草三萜有效部位中熊果酸的含量

　　【摘要】 目的：建立新疆鼠尾草以三萜为有效部位的熊果酸含量的高效液相色谱检测方法。方法：采用高效液相色谱法(HPLC法)检测浸膏中熊果酸的含量,色谱柱为Waters Symmetry C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇—水—冰乙酸—三乙胺(85∶15∶0.03∶0.06)∶甲醇=70∶30，流速0.8 ml/min，检测波长210 nm，柱温30℃。结果：HPLC法测得熊果酸的线性范围为Y=447 684X-7 680 (r=0.999 9)，平均回收率为98.84%，RSD=1.69% (n=6)。结论：HPLC法测定熊果酸含量，操作简便，灵敏度高，重现性好，可为新疆鼠尾草以三萜为有效部位的质量控制提供一定的依据。

　　【关键词】 高效液相色谱法; 新疆鼠尾草; 熊果酸; 含量测定

　　基金项目：国家“十一五”科技支撑计划项目(300243)

　　The determination of Ursolic Acid in Salvia deserta Schang by HPLC

　　CHEN Tingting, Rena·Kasimu

　　Department of Phytochemistry Pharmacognosy, Pharmacy College, Xinjiang Medical University,

　　Urumqi 830011, China

　　Abstract: Objective: To establish new methods for the determination of ursolic acid in Salvia deserta Schang. Methods: High performance liquid chromatography detection (HPLC) was used, using Waters Symmetry C18 column (4.6 mm×250 mm, 5μm), methanolwateracetic acid glacialtriethylamine (85∶15∶0.03∶0.06)∶Methanol=70∶30 as mobile phase with flowing rate 0.8 ml/min and detected at 210 nm. Results: The linear range of ursolic acid was 0.204～2.040 μg (r=1.000 0), and the average recovery was 98.84%, RSD=1.69% (n=6). Conclusion: This method is simple, accurate and reproducible. It provides a basis for the quality evaluation of total triterpenes as effect extracts in Salvia deserta Schang.

　　Key words: high performance liquid chromatography (HPLC); Salvia deserta Schang; ursolic acid

　　新疆鼠尾草(Salvia deserta Schang)为唇形科(Labiatae)鼠尾草属植物。我国鼠尾草属植物大多数以根入药作丹参用[1]。新疆鼠尾草在新疆有广泛的分布，在民间全草用药，用于清热解毒、抗菌消炎等。在新疆鼠尾草地上部分的基础研究中，发现三萜酸为其主要成分之一，其中以熊果酸(Ursolic Acid)和齐墩果酸(Oleanolic Acid)含量明显占优势。有关研究报道熊果酸和齐墩果酸的药理作用主要为保肝护肝、抗炎抗菌抗病毒、抗氧化、抗癌等作用[2,3]。本实验以新疆鼠尾草地上部分甲醇提取的浸膏为对象，经过简单的富集步骤，得到熊果酸高含量的三萜有效部位，旨在建立新疆鼠尾草中熊果酸的高效液相色谱(HPLC)定量检测方法,为新疆鼠尾草三萜有效部位的质量控制提供了一定的依据。

　　1仪器与试药

　　岛津LC20A型液相色谱系统(LCSolution (Ver.1.21)系统色谱工作站, SPDM20A紫外检测器, CTO20AC型柱温箱);Sartorius BS110S电子天平(北京)。熊果酸对照品(批号110742200516)购自中国药品生物制品检定所;甲醇(色谱纯)，水(市售纯净水)，其它试剂均为分析纯，富含熊果酸的三萜有效部位为自制品。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件色谱柱为Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为甲醇—水—冰乙酸—三乙胺(85∶15∶0.03∶0.06)∶甲醇=70∶30，配好后经微孔滤膜抽滤，超声波脱气;流速0.8ml/min;检测波长210 nm;柱温30℃。熊果酸对照品和新疆鼠尾草有效部位的HPLC图,见图1。

　　2.2对照品溶液和提取物溶液的制备精密称取熊果酸对照品5.1 mg，加甲醇定容到25 ml，制成0.204 mg/ml对照品溶液。将新疆鼠尾草地上部分甲醇提取的浸膏用乙酸乙酯萃取，干燥后用石油醚溶解，过滤，取滤饼，即得富含熊果酸的三萜有效部位。称取有效部位，精密称定，甲醇溶解后转移至容量瓶，甲醇定容至刻度，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得提取物溶液。

　　2.4精密度考察取熊果酸对照品溶液10 μl，连续进样 6次，按上述色谱条件测定峰面积，精密度相对标准偏差RSD为0.51%,表明仪器精密度良好。

　　2.5稳定性试验精密称取有效部位0.030 0 g, 甲醇溶解后定容至50 ml容量瓶，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，分别在0、2、4、6、8 h进样 10 μl测定，以峰面积计算，RSD为0.27%，表明样品溶液在 8 h内稳定。

　　2.6重复性考察称取有效部位约 0.03 g，共6份，甲醇溶解后定容至 50 ml容量瓶，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，按上述色谱条件各进样 10 μl测定峰面积， RSD为1.11%,表明本方法重复性符合分析要求。

　　2.7加样回收率试验精密称取有效部位6份，分别精确加入对照品溶液1.00 ml，甲醇溶解后定容至25 ml容量瓶，微孔滤膜(0.45 μm)滤过，进样10 μl测定峰面积，计算回收率。 结果熊果酸的平均加样回收率为98.80%, RSD=1.71%，表明分析方法准确，见表1。表1熊果酸加样回收率(n=6)编号样品取样(略)

　　2.8样品含量测定

　　精密吸取提取物溶液 10 μl进样，按上述色谱条件，用外标法计算熊果酸的含量，测得结果表明富含熊果酸的三萜有效部位中熊果酸的含量为32.53%，RSD=0.40%(n=6)。

　　3结论

　　3.1甲醇—水的流动相优于甲醇—乙腈—水，添加剂为冰醋酸三乙胺对UA、OA的分离度高于添加剂为磷酸的流动相[4]，故初步选定以甲醇—水—冰乙酸—三乙胺作为流动相。其中，甲醇水有85∶15和90∶10共2种[5,6]，本实验选择前者，在预实验中发现色谱图不够理想，最终采用甲醇—水—冰乙酸—三乙胺(85∶15∶0.03∶0.06)∶甲醇=70∶30，接近甲醇—水—冰乙酸—三乙胺(90∶10∶0.03∶0.06)，提示后者分离熊果酸效果也较好。加入少量冰醋酸可以创造弱酸性环境，利于2种酸的分离;加入少量三乙胺有利于改变峰形，提高分离度[5]。

　　3.2 实验中采用全波长扫描，观察了206、210、215、220 nm共4个波长扫描的情况，发现206 nm和210 nm的灵敏度高，215 nm和220 nm的基线比较稳，综合考虑，选择波长为210 nm。

　　3.3本实验参考文献[7]按照不同的进样体积进样等浓度的标准品溶液，操作简便，且减少操作引起的误差，以峰面积对熊果酸的质量进行线性回归，绘制的标准曲线相关系数r=0.999 9。

　　3.4在前期对浸膏进行柱层析中发现熊果酸的含量高于齐墩果酸，通过HPLC色谱图可以看到相同量的样品中，熊果酸的峰面积明显高于齐墩果酸。且实验中有效分离了齐墩果酸的峰和熊果酸的峰，既使得熊果酸的含量测定更为精确(排出了齐墩果酸的干扰)，又建立了同时测定熊果酸和齐墩果酸的色谱方法，为以后同时测定两者的含量奠定了实验基础。

　　3.5本实验建立了新疆鼠尾草以三萜为有效部位的熊果酸含量测定的HPLC方法。经方法学考察,该方法符合《中国药典》中有关质量标准建立的要求[8] ,具有快速灵敏、准确可靠、简便易行、重现性好等优点,可用于控制新疆鼠尾草三萜有效部位中熊果酸的含量。

　　【参考文献】

　　[1]常军民,堵年生.鼠尾草属植物化学成分研究进展[J].中成药,1999,21(9):480482.

　　[2]杜瑜,李焕德.齐墩果酸的研究进展[J].中国药房,2006,17(4):304306.

　　[3]章洛汗,廖晓峰.食品新功能因子熊果酸的研究进展[J].广州食品工业科技,2004,20(3):139141.

　　[4]杜丰玉,陈钧,宣寒.RPHPLC测定枇杷叶中熊果酸和齐墩果酸的含量[J].中成药,2006,28(12):17901793.

　　[5]相延英,杨光.常用中药中齐墩果酸和熊果酸的含量测定[J].中国医院药学杂志,2004,24(5):316318.

　　[6]谢艳,林圣云,任其龙.白花蛇舌草中齐墩果酸和熊果酸的HPLC测定[J].中国医药工业杂志,2006,37(8):559560.

　　[7]刘成红,刘云.高效液相色谱法测定马鞭草中熊果酸的含量[J].中国中药杂志,2002,27(12):916917.

　　[8]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].2005版.北京：北京工业出版社，附录ⅩⅧ,附录114.