PCRBHEL技术的建立及对血清中丙肝病毒的检测

　　【摘要】 目的：探讨聚合酶链反应偶联印迹杂交和酶联放大技术(PCRBHEL)在检测血液传染性病毒中的优越性。 方法：采用PCRBHEL检测129例抗HCV阳性和45例抗HCV阴性的血清标本，并将该项技术与逆转录聚合酶链反应(RTPCR)的检测结果进行比较。结果：PCRBHEL检测129例抗HCV阳性标本的HCV RNA检出率为78.29%，45例阴性标本的HCV RNA检出率为6.67%;采用RTPCR检测的HCV RNA检出率分别为62.02%和2.22%。PCRBHEL技术对HCV　RNA的检出率高于RTPCR，差别有统计学意义(P<0.001)。结论：PCRBHEL较RTPCR技术的灵敏度高，能够有效地提高HCV RNA的检出率，可推广应用于其他传染性病毒的检测。

　　【关键词】 聚合酶链反应偶联印迹杂交和酶联放大技术; 丙肝病毒; 检测

　　Establishment of PCRBHEL technology and detection of hepatitis C virus in serum

　　YU Xiaofang, LIU Yi, XU Yan, et al

　　The College of Preclinical Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China

　　Abstract: Objective： To establish sensitive method for detecting infectious virus in blood. Methods： 174 HCVpositive and HCVnegative serum samples (detected by ELISA) were detected with polymerasechain reaction coupled with blothybridization and enzymelinked technology (PCRBHEL) and RTPCR respectively. Results： The HCV RNA positive rates of 129 HCVpositive serum samples and 45 HCVnegative serum samples (detected by ELISA) were 78.29% and 6.67% respectively when they were detected by PCRBHEL while the positive rates were 62.02% and 2.22% respectively when they were detected by RTPCR. Conclusion： The results imply that PCRBHEL is a sensitive method and can be applied in the detection of other infectious viruses in blood.

　　Key words: PCRBHEL; HCV; detection

　　丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus ，HCV)是急、慢性丙型肝炎的病原体，HCV为嗜肝性慢性病毒，HCV感染后，患者的起病和临床症状极不典型，而且易慢性化，早期可出现肝硬化、肝癌[1]。感染者血清中抗HCV出现较晚或不出现，单凭血清学诊断容易造成漏诊。在HCV感染后的1～2周内血清中即可检测到HCV RNA ，是HCV复制活跃的可靠指标。因此，掌握患者HCV RNA水平，对于早期诊断丙型肝炎病毒感染者以及指导临床治疗、判断预后均有重要意义。近年来,国内在对HCV RNA的检测方面进行了很多研究，如巢式PCR、 荧光定量PCR、PCR微孔板探针杂交等[2]，但还未见聚合酶链反应偶联印迹杂交和酶联放大技术(PCRBHEL)的报道。本研究采用PCRBHEL技术检测129例抗HCV阳性和45例抗HCV阴性的血清标本中HCV RNA，并与逆转录聚合酶链反应(RTPCR)的检测结果进行比较，以证实该项技术在检测血液传染性病毒中的优越性(高特异性、高敏感性),为血液传染性病毒检测提供更为敏感、可信的方法。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　来源174例标本分别来自新疆医科大学第一附属医院肝病中心2006年10月～2007年3月住院、门诊病人及2007年1～3月新疆昌吉五家渠劳教所入所的劳教人员。其中男性124例，年龄15～83岁，平均(37±1)岁;女性50例，年龄14～75岁，平均(47±1)岁;汉族97例，维吾尔族64例，哈萨克族4例，回族6例，蒙古族1例，俄罗斯族1例，满族1例。标本采集后4 h内分离血清置-70℃低温保存备用。

　　1.2主要仪器和试剂

　　PE2400型基因扩增仪(美国PE公司);shake′n stack杂交仪(英国Thermo hybaid公司);Sunrise酶联免疫分析仪(瑞士TECAN公司);抗HCV检测试剂盒购自北京万泰生物药业有限公司;Trizol LS 试剂购自Gibco公司;OligodT购自Invitrogen公司;DTT、2×Taq PCR master mix购自Abm公司;RNA酶抑制剂、dNTPs购自Applied Biosystems公司;AMV逆转录酶购自QIAGEN公司; 5×RT buffer购自Invitrogen公司;抗体购自Applied Biological Materials公司。

　　1.3引物及探针的设计和合成引物及探针均由SIGMA公司合成。内参照上游引物：5′CTTCAAGGACGACGGCAACT3′，下游引物：5′CTCCAGCAGGACCATGTGAT3′;HCV1上游引物：5′GGCCAGATTACCGGCCACCG 3′，下游引物：5′AAGCTCGACAAGGTAGAACC3′;HCV2上游引物：5′GTTGTCTTCGGTGGC CACTG3′;下游引物：5′GTTGATTAAGTGGAGCTGCT3′。HCV 探针:ccggccaccgcatggcatgggacatgatgttaaactggtcaccaaccctcaccatgatccttgcctac

　　gctgctcgtgttcctgagctagtccttgaagttgtcttcggtggccactg

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　　ctcttcacctttggtccccagcagcagctccacttaatcaac。

　　1.4方法

　　1.4.1PCRBHEL检测HCV RNA(1)血清中HCV RNA的提取

　　按Trizol LS试剂说明书进行。(2)RTPCR:取DEPC处理水 9 μl，10 mmol/L dNTPs 1 μl，50 ng/μl OligodT 1 μl及提取的RNA 1 μl，混匀后置75℃，反应5 min后置42℃，加入逆转录反应液(含5×RT缓冲液 4 μl，0.1 M DTT 2 μl，RNA酶抑制剂 1 μl，AMV 逆转录酶1 μl)，反应总体积共计20 μl，混匀后42℃逆转录60 min，所得cDNA即可用作PCR反应模板。用HCV1 和HCV2对cDNA分别在两管内进行PCR扩增，即50 μl PCR反应体系，包括：2×Taq PCR master mix 25 μl，ddH2O 22 μl，cDNA 1 μl， HCV1 primer各0.5 μl 或HCV2 primer各0.5 μl，内参照primer各0.5 μl。将反应体系混匀后按照以下反应条件进行:95℃预变性5 min,39个扩增循环为94℃1 min、55℃1 min、72℃1 min, 最后72℃延伸7 min。对健康人血清提取后进行扩增作为阴性对照，对经荧光定量检测HCV RNA水平>107 copies/ml 患者血清提取后进行扩增作为阳性对照，对ddH2O扩增作为空白对照。(3)southern杂交:RTPCR的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后按照向上毛细管转移法[3]进行southern转移，将扩增产物转印至NC膜上，紫外线交联后，在杂交液(5×SSC、5×Denhardt′s solution、50%去离子甲酰胺、1%SDS)中于55℃预杂交20 min后，再在含有地高辛标记的HCV探针及内参照探针的新鲜杂交液中55℃杂交60 min。TBST洗膜后，将新配制的显色液滴在NC膜上，置于暗室显色30 min，照相记录结果。

　　1.4.2抗HCV检测采用ELISA法,操作严格按试剂盒说明书及免疫学要求进行。

　　1.5统计学处理

　　采用SPSS10.0统计软件进行统计学处理,采用χ2检验，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1RTPCR扩增后典型电泳图PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在255 bp和206 bp任意一处出现扩增条带者即为阳性，见图1。

　　2.2印迹杂交偶联酶联放大后对应NC膜图NC膜上同样与阳性对照出现显色带者为阳性，见图2。

　　2.3RTPCR和PCRBHEL检测HCV RNA的结果比较

　　经RTPCR法检测出HCV RNA 81例，检出率为46.55%。其中，129例抗HCV阳性血清中检出HCV RNA 80例，检出率为62.02%;45例抗HCV阴性血清检出HCV RNA 1例，检出率为2.22%。174例血清标本经PCRBHEL法检测出HCV RNA 104例，检出率为59.77%。其中，129例抗HCV阳性血清中检出HCV RNA 101例，检出率为78.29%;45例抗HCV阴性血清检出HCV RNA 3例，检出率为6.67%(表1)。PCRBHEL法对HCV RNA的检出率高于RTPCR法，差别有统计学意义，(P<0.001)，见表2。表1RTPCR和PCRBHEL检测HCV RNA结果的比较(略)表2RTPCR与PCRBHEL检测HCV RNA的结果比较(略)

　　3讨论

　　HCV感染是世界范围的健康问题[4]，我国的HCV感染率也相当高[5]。近年来，国内外对HCV诊断方法的研究有了很大突破和进展，从血清学方法检测HCV抗体，发展到如今运用分子生物学方法直接检测病毒分子本身。目前，血清学方法对抗HCV的检测，特异性超过99%，但仍不能排除极少数的漏检者[6]。本研究结果显示，45例抗HCV阴性血清中经PCRBHEL法检出3例HCV RNA阳性，原因可能主要有：(1)不同患者的免疫状态不同，当患者免疫功能低下时，对HCV感染产生的抗体水平低，有的甚至不产生抗体。(2)HCV感染后一般到抗体转阳，有一个较长的窗口期，平均为70 d，有的患者窗口期可延长至6～9个月甚至更长，约1%～3%的患者抗HCV可持续阴性[7]，而病毒基因组的复制出现的很早，感染后数天即出现病毒血症。Willems等[8]检测克罗地亚不同地区输血中心的2 718份抗HCV阴性血浆中2.1%为HCV RNA阳性。另外，美国已报道了1例抗HCV阴性的器官捐赠者对接受移植者造成丙型肝炎病毒急性感染[9]。 (3)HCV感染后一般7～8周可出现血清学转换，约50%～70%的患者在出现临床症状时可以检测到抗HCV，抗HCV在体内存在的时间因人而异，自限性感染者抗HCV可以在体内终生存在，慢性HCV感染者的部分患者滴度可轻度降低或数年后逐渐消失[10]。 本研究发现，PCRBHEL法对HCV RNA的检出率明显高于RTPCR法，而且有效防止了假阴性的发生：129例抗HCV阳性血清中经RTPCR法未检出HCV RNA的21例血清标本在经印迹杂交偶联酶联放大反应后呈阳性结果;45例抗HCV阴性血清经RTPCR法未检出HCV RNA的2例血清标本在经印迹杂交偶联酶联放大反应后呈阳性结果。其原因是PCRBHEL技术是在对HCV分子生物学和血清学诊断学研究的基础上 ,进一步发展起来的HCV分子诊断技术。普通RTPCR只设计1对引物，而该技术设计了2对引物(HCV1和HCV2)，对HCV同时检测2个不同的区段，增加了其灵敏度，即使病毒发生了变异也能被检测，减少了假阴性;其次，普通RTPCR难以检测出微量病毒，而该技术是将血清中微量的病毒经过PCR的扩增得以放大之后再用地高辛标记的探针进行检测，即增强了检测的特异性，防止了假阳性;同时引入酶联技术，使微弱的靶信号再度放大，提高了灵敏度。综上所述，PCRBHEL技术较普通RTPCR的灵敏度高，可以有效地减少假阳性、假阴性;同时能够在HCV感染早期抗HCV阴性时检出HCV RNA,有利于HCV的早期诊断。因此，该技术为HCV的检测提供了一种更为灵敏和特异的方法，可推广适用于临床HCV的检测与诊断。同时该项技术的建立也可推广应用于其它血液传染性病毒的检测，为研究其它血液传染性病毒的检测方法开辟了新的途径。(感谢新疆医科大学第一附属医院肝病中心在本研究中给予的大力支持与帮助)。

　　【参考文献】

　　[1]Afdhal NH. The natural history of hepatitis C[J]. Semin Liver Disease, 2004,24:38.

　　[2]杨国翠，邵大晓，冯艳铭,等. 核酸扩增(PCR)微孔板探针杂交法在临床标本 HCV RNA检测中的应用[J].中国输血杂志,2001,(14)增刊：7.

　　[3]J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔著.分子克隆实验指南[M].第3版.北京:科学出版社,2002,488.

　　[4]Cook L, Ng KW, Bagbag A, et al. Use of the MagNa pure LC automated nucleic acid extraction system followed by realtime reverse transcriptionPCR for ultrasensitive quantitation of hepatitis C virus RNA[J]. Clin Microbiol,2004,42:41304136.

　　[5]王耀宗.正视我国丙型肝炎的严重性[J].中华传染病杂志,2003,21:211213.

　　[6]吴国桥,茹兴龙.血液制品抗HCV酶免疫检测方法探讨[J].浙江实用医学,2005,10(3):216217.

　　[7]庄辉.重视丙型肝炎的研究[J].中华肝脏病杂志,2004,12: 6566.

　　[8]Willems M, Metselear HJ, Jilanus HW, et al. Liver transplantation and hepatitis C[J]. Transpl Int, 2002, 15:6172.

　　[9]Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Hepatitis C Virus transmission from an antibodynegative organ and tissue donorUnited States, 2000 to 2002[J]. Morb Mortal Wkly Rep , 2003,52:273274.

　　[10]杨东亮.丙型肝炎的病毒学检测指标及其临床意义[J].中华肝脏病杂志,2004,12(2):104.