阿尔茨海默病与ApoE基因多态性研究

　　作者：骆小梅，周晓辉 作者单位：新疆医科大学第一附属医院干部心血管一科, 新疆乌鲁木齐830011

　　【摘要】 目的：探讨新疆汉族人群载脂蛋白E(ApoE)基因多态性与阿尔茨海默病(AD)的关系。 方法：选择98例诊断很可能是AD的汉族患者(AD组)及103例正常对照者(对照组)，应用聚合酶链反应限制性片断长度多态性分析(PCR RFLP)方法测定ApoE基因型和等位基因频率。 结果：(1)AD组ε3/4基因型频率为25.51%，高于对照组的11.65%(P<0.05)，2组ε3/3和ε2/3基因型分布差异无统计学意义。AD组和对照组ApoEε4等位基因频率分别为13.78%和6.31%，差异有统计学意义(P<0.05)。(2)AD组和对照组女性ApoEε4等位基因频率分别为14.52%和6.92%，差异亦具有统计学意义(P<0.05)。 结论：ApoEε4等位基因是AD的危险因素，尤在女性AD患者的发病中起重要作用。

　　【关键词】 阿尔茨海默病; 载脂蛋白E; 基因型; 多态性

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(30460140)

　　The study of Apolipoprotein E gene polymorphism with Alzheimer′s Disease

　　LUO Xiaomei， ZHOU Xiaohui

　　Department of Cadre, First Affiliated Hospital， Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China

　　Abstract: Objective: To study the relevance of Apolipoprotein E gene polymorphism and Alzheimer′s disease(AD) in Xinjiang Han people. Methods: Using polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism (PCRRFLP), to determine the apolipoprotein E genetypes and allele frequency in 98 cases of Han Alzheimer′s disease patients, and 103 cases of normal control. Results: (1) The ε3/4 genetype in AD group was 25.51%, was higher than that in normal control 11.65% (P<0.05). But there were not difference in ε3/3 genetype and ε2/3 genetype from AD group and normal control. The allele frequency of ApoEε4 was higher in AD group than that in normal control, 13.78% and 6.31% (P<0.05). (2) ApoEε4 allele frequency in women in AD group and normal control such as 14.52% and 6.92%, this difference also had statistically significance (P<0.05). Conclusion: ApoEε4 allele frequency is a risk factor of Alzheimer′s disease, especially in femal AD patients.

　　Key word: Alzheimer′s disease; apolipoprotein E; genetypes; polymorphism

　　阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)，即老年性痴呆,是一多发生在老年，以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、抽象思维和计算损害、人格和行为改变为主要临床特征，以老年斑(SP)、神经元纤维缠结(NFT)为主要病理改变的进行性神经变性疾病。AD在发达国家已经成为次于心血管病、肿瘤和卒中而位居第4位的致死性疾病。近百年来,人们一直在探索着AD 的病因，认为AD的发生不是单一因素所引起，而是由多病因、遗传因素和环境因素共同作用的遗传异质性疾病。已有研究发现，与AD发病有关的候选基因达到近百种, 而ApoE、淀粉样蛋白前体(APP)基因、早老素1(PS1)基因和早老素2(PS2)基因、α2巨球蛋白(A2M)基因与AD密切相关[1]。ApoEε4等位基因是AD的遗传危险因素，尤在晚发性AD中起重要作用，其存在还可使AD发病年龄提早[2，3]。本研究在流行病学调查的基础上选取诊断为很可能是AD的患者进行病例对照研究，对其基因型及等位基因频率的差异进行分析，为新疆地区汉族人群AD的ApoE基因多态性研究提供基础资料。

　　1对象和方法

　　1.1研究对象

　　在新疆流行病学调查(流调)的基础上选择诊断很可能是AD的汉族病例98例为AD组，平均年龄(69.59±8.65)岁，男性36例，女性62例。选择生活背景与AD患者相同，并且经严格检查后无血缘关系的健康者 103例为对照组，平均年龄(69.64±8.03)岁，男性38例，女性65例。2组年龄、族别、性别、文化程度均相匹配。AD诊断标准：采用美国国立神经病、语言交流障碍和脑卒中研究所—阿尔茨海默病及相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)标准，最终做出很可能是AD的诊断。AD排除标准：严格排除血管性痴呆、帕金森氏性痴呆及脑器质性疾病所致的各种痴呆。

　　1.2方法

　　采用分层随机整群抽样方法，抽取新疆北疆、南疆、东疆、昌吉及乌鲁木齐市的年龄≥50岁汉族常住居民3 596例进行AD流行病学调查。所有调查对象均进行一般资料的记录、全身体格检查及神经系统检查，应用Hachinski 缺血指数量表(HIS)、日常生活能力量表(ADL)、AD诊断性量表、Fuld物体记忆试验、言语流畅性测验等进一步细查，部分诊断有困难者进行脑CT和MRI检查。每个病例由新疆医科大学课题组根据病史、体检、量表测试成绩，结合CT及MRI进行反复讨论分析，最后做出很可能是AD的诊断。

　　1.3主要仪器和试剂

　　Beckman L855型超速离心机、METTLER TOLEDO LD202电子天平、DK8A快速恒温数显水箱、DYCP31DN型水平电泳槽、DYY6C型电泳仪、GILSON移液器、日本SanYo MDFU52V超低温冰箱、BIORAD Gel DOC 2000 凝胶成像仪、PCR热循环仪为BIORAD公司产品;蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶HhaⅠ为上海生工生物工程公司产品。

　　1.4血标本的采集

　　在流调基础上采集很可能是AD的汉族患者及部分健康者外周静脉血5 ml,EDTA抗凝，放置于-70℃冻存,用于DNA的提取。

　　1.5基因组DNA的制备

　　取静脉血2 ml，EDTA抗凝，应用北京百泰克试剂盒提取基因组DNA。

　　1.6ApoE基因的PCR扩增及酶切消化引物

　　按参考文献[4]设计，由上海生工生物工程技术有限公司合成。上游引物序列为5′ AGAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC3′，下游引物序列为5′TAAGCTTGGCAGGCTGTCCAAGGA3′。30 μl PCR反应体系包含：DNA模板3 μl，10×PCR反应缓冲液(不含Mg++)3 μl，25 mmol/L MgCl2 2.2 μl，2 mmol/LdNTP0.45 μl，二甲基亚酚(DMSO)3 μl，10 μmmol/L上游引物和下游引物各1.5 μl，Tag DNA聚合酶0.75 U，去离子水15.2 μl。PCR反应条件为：95℃预变性5 min， 95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环后，72℃继续延伸10 min后降至4℃。PCR产物经限制性内切酶HhaⅠ于37℃水浴中充分酶切消化，经5%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色,紫外灯下观察并摄影。

　　1.7统计学处理

　　采用SPSS13.0统计软件包进行处理，吻合度检验确定是否符合HardyWeinberg平衡定律，ApoE基因型频率和等位基因频率以百分率(%)表示，组间比较用卡方(χ2)检验,检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1AD组与对照组ApoE基因型和等位基因频率分布比较

　　AD组和对照组中ε3/3基因型频率最高，ε3/4和ε2/3基因型次之，ε4/4和ε2/4基因型最少，未鉴别到ε2/2基因型。AD组ε3/4基因型频率为25.21%,高于对照组的11.65%，差异具有统计学意义(χ2=6.423，P<0.05)。AD组ε3/3基因型频率为61.22%,低于对照组的68.93%，差异无统计学意义。AD组ε2/3基因型频率为12.24%，略低于对照组的18.45%，但差异亦无统计学意义。AD组ApoEε4等位基因频率为13.78%，高于对照组的6.31%，差异有统计学意义(χ2=6.246，P<0.05)，2组ApoEε3和ApoEε2等位基因频率差异均无统计学意义(表1)。表1AD组和正常对照组ApoE基因型及等位基因频率比较(略))注： 与对照组比较， *P<0.05

　　2.2AD组与对照组不同性别ApoE基因型和等位基因频率分布比较

　　AD组和对照组ε3/3、ε2/3和ε3/4基因型在男、女不同性别中的频率分布差异无统计学意义。AD组和对照组女性ApoEε4等位基因频率分布分别为14.52%和6.92%，差异有统计学意义(χ2=3.852，P<0.05)，而在男性无明显差异。AD组和对照组ApoEε2和ApoEε3等位基因频率在不同性别间的比较亦无统计学意义(表2)。表2不同性别AD组和对照组ApoE基因型及等位基因频率比较(略)注： 与对照组比较， *P<0.05

　　3讨论

　　ApoE基因位于第19号染色体长臂13区2带(19q13，2)上，基因全长为3.7 kb，含有4个外显子和3个内含子。ε2、ε3和ε4等位基因产生6种基因型，即ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε2/3、ε2/4 、ε3/4，相对应6种遗传表现型，即ApoE2/2、ApoE3/3、ApoE4/4纯合子表现型和ApoE2/3、ApoE2/4、ApoE3/4杂合子表现型[5]。ApoE第112位和158 位氨基酸序列的不同决定了异构体的种类。目前已有许多研究表明,ApoEε4等位基因是AD的危险因素，且ApoE基因频率和表现型有种族和地域的差别[3,6]。携带ApoEε4等位基因者患AD的危险性增加且发病年龄趋小，无论是纯合子还是杂合子，AD存在的危险性都将增加[7]。

　　本研究结果显示AD组ApoEε4等位基因频率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。考虑ApoEε4等位基因可能是AD的危险因素，同时也证实在基因型方面AD患者所携带的ε4等位基因的主要形式为ε3/4杂合子型，而不是ε4/4纯合子型，与国内外报道的结果基本一致。有关研究表明，亚洲的AD患者ApoEε4等位基因出现的频率较多数欧洲和北美人低[8]。本研究结果表明AD患者ApoEε4等位基因频率(13.78%)接近于日本的报道16.4%[9]，但明显低于芬兰、美国高加索人种和非洲裔美国人的38.6%、36.7%和33.2%[10,11],进一步证实了ApoEε4等位基因频率的分布具有种族和地域的差别。

　　本研究结果还显示,AD组和对照组女性ApoEε4等位基因频率分布具有统计学差异(P<0.05)，而在男性或男女性之间未见明显差异。雌激素对AD具有保护作用，其可能促进了APP的破坏，从而减少了β淀粉样蛋白(Aβ)的堆积。国外对绝经期妇女所进行的调查发现，绝经期妇女AD的发病率较同龄男性高，可能与老年女性体内性激素的变化特点有关，也可能与女性预期寿命比男性长有关。

　　因此考虑ApoEε4等位基因频率在女性AD患者中可能与其它的危险因素并存且相互影响，使女性AD的患病率高于男性。本研究结果再次证明，ApoEε4等位基因是AD的危险因素，然而并不是所有AD患者都携带ApoEε4等位基因。在AD的危险因素中，除ApoEε4等位基因外，还有其它的遗传、环境和地域等因素在共同起作用。因此，对ApoEε4等位基因的致病机制以及与其它相关危险因素的相互作用等方面，还有待于进一步的深入研究。

　　【参考文献】

　　[1]Rocchi A, Pellegrini S, Siciliano G, et al. Causative and susceptibility genes for Alzheimer′s disease: a review[J].Brain Res Bull, 2003,61: 124.

　　[2]Poirier J, Minnich A, Davignon J, et al. Synaptic plasticity and Alzheimer′s disease [J]. Ann Med, 1995,27:663701.

　　[3]Horsburgh K, Fitzpatrick M, Nilsen M, et al. Marked alterations in the cellular bcalization and levels of apolipoprotein E following acute subdural haematoma in rat [J]. Brain Res, 1997,736:103105.

　　[4]贾建平，张津，徐敏,等.载脂蛋白E基因多态性与散发性阿尔茨海默病的关系[J]. 中华老年医学杂志，2002，21(4)：248250.

　　[5]蔡建光，印大中.阿尔茨海默病主要相关基因及其功能蛋白研究进展[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，2006,13(2):120124.

　　[6]Ali SM, Dunn E, Oostveen JA, et al. Induction of apolipoprotein E, mRNA in the hippocampus of the gerbil after transient gbbal ischemia [J]. Brain Res Mol Brain Res, 1996,38:3744.

　　[7]宋洁，郑广娟.载脂蛋白E与阿尔茨海默病[J]. 中华老年医学杂志,2005,6(25)：738740.

　　[8]Farrer LA, Cupples LA, Haines JL, et al. Effects of age, sex, and ethnicity on the association between apolipoprotein E genotype and Alzheimer disease : a metaanalysis. ApoE and Alzheimer Disease Meta Analysis Consortium [J]. JAMA,1997,278(16):1349.

　　[9]Dai XY, Nanko S, Hattori M, et al. Association apolipoprotein E4 with sporadic Alzheimer′s disease in more pronounced in early onset type[J]. Neurosci Lett, 1994,175:7476.

　　[10]Lehtovirta M, Helicalmi S, Mannermaa A, et al. Apolipoprotein E polymorphism and Alzheimer′s disease in eastern Finland[J]. Neurosci Lett,1995,185:1315.

　　[11]Lindsay AF, Adrienne C, Jonathan LH, et al. Effect of age, and ethnics on association between ApoE genotype and AD[J]. JAMA, 1997, 278: 13491356.