维、哈及汉族儿童维生素D受体基因FokⅠ位点多态性的研究

　　【摘要】 目的: 了解维生素D受体基因FokⅠ多态性在维吾尔族(维族)、哈萨克族(哈族)及汉族儿童中的分布。方法： 应用聚合酶链式反应限制性片断长度多态性(PCRRFLP)技术，分析499名维族、525名哈族及489名汉族儿童的维生素D受体基因FokⅠ位点基因型和等位基因分布频率及差异。结果： FF、Ff、ff 3种基因型在维族中分别占54%、38%、9%，哈族中占49%、45%、7%，汉族中占38%、51%、11%;F、f等位基因分布频率在维族为72.4%、27.6%，哈族为70.9%、29.1%，汉族为63.4%、36.6%。基因型和等位基因的分布频率在维、汉民族间的差异有统计学意义(χ2=21.898、P<0.001;χ2=17.258，P均<0.001)，哈、汉族间有统计学意义(χ2=14.539，P<0.001;χ2=13.433，P<0.001),而维、哈族间维生素D受体基因型分布频率差异无统计学意义(χ2=4.754，P>0.05;χ2=0.576，P>0.05)。结论： 维生素D受体基因FokⅠ位点基因型及等位基因在不同种族间分布频率有差异。

　　【关键词】 维生素D受体基因; FokⅠ; 遗传多态性; 维族; 哈族; 汉族

　　Study on polymorphism of vitamin D receptor gene FokⅠin the Uygurs, Kazaks and Hans

　　TIAN Wei, CHEN Yan, ZHAO Jiangxia, et al

　　Toxicology Laboratory, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China

　　Abstract: Objective: To investigate the polymorphism distribution of vitamin D gene FokⅠ in Uygurs, Kazaks and Hans. Methods: Polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism (PCRRFLP) method was used to analyze three gene types FF, Ff and ff in the exon of VDR gene (FokⅠ) in Uygurs, Kazaks and Hans. Results: The frequencies of FF, Ff and ff genotypes were found to be 54%, 38%, 9% in Uygurs, and 49%, 45%, 7% in the Kazaks, and 38%, 51%, 11% in the Hans respectively. The frequencies of allele were found to be72.4%, 27.6% in the Uygurs, and 70.9%, 29.1% in the Kazaks, and 63.4%, 36.6% in the Hans. Significant differences were seen in the frequency distribution of VDR genotype and allele between Uygurs and Hans (χ2=21.898，P<0.001; χ2=17.258，P<0.001), and significant differences were seen in the frequency distribution of VDR genotype and allele between Kazaks and Hans (χ2=14.539，P=0.001; χ2=13.433，P<0.001). There were indifferences in the frequency distribution of VDR genotype and allele between Uygurs and Kazaks(χ2=4.754，P>0.05;χ2=0.576，P>0.05). Conclusion: A significant difference was seen in the frequency distribution of VDR genotype and allele between the different races.

　　Key words: vitamin D receptor gene; FokⅠ; genetic polymorphism; Uygur nationality; Kazak nationality; Han nationality

　　维生素D受体(vitamin D receptor , VDR)是介导1，25(OH)2D3发挥生物效应的核内生物大分子，在靶细胞与1，25(OH)2D3结合形成激素受体复合物，该复合物作用于靶基因的特定DNA序列，从而对基因的表达产生调节作用。因此，VDR在本质上是一种配体依赖的核转录因子，它在维持机体钙、磷代谢方面起重要作用,并与其他激素如甲状旁腺激素一起主要用来维持体内钙和磷的动态平衡，调节骨骼代谢[1]。近年来，维生素D受体基因被认为是遗传调控骨和钙代谢的候选基因。人类VDR基因定位于常染色体12q12～q14，有11个外显子，全长75 kb。Fok Ⅰ位点(等位基因F、f)位于其2号外显子。国内外研究表明FokⅠ酶切位点基因多态性与许多疾病(如骨质疏松、佝偻病、铅中毒、前列腺癌、乳腺癌等)有相关性[2～6]。目前已有对我国汉族、阿昌族、蒙古族等人群维生素D受体基因FokⅠ位点多态性的报道[7,8]。本研究应用聚合酶链式反应限制性片断长度多态性(Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism, PCRRFLP)技术对新疆乌鲁木齐市维吾尔族(维族)、哈萨克族(哈族)、汉族儿童维生素D受体基因Fok Ⅰ位点的多态性进行了研究，并进行比较，同时还与世界其它国家人群进行比较，了解维生素D受体基因Fok Ⅰ多态性分布频率，为进一步观察其遗传易感性与骨代谢性疾病的关系及在基因水平诊断和防治相关的疾病提供理论依据。

　　1对象与方法

　　1.1研究对象

　　在乌鲁木齐地区范围内，采取整群抽样的方法，抽取相互间无血缘关系的6～10岁在校学生共1 513名，其中维族499名,哈族525名,汉族489名。

　　1.2研究方法

　　1.2.1DNA提取取外周血2 ml，利用常规盐析法从全血中提取DNA。

　　1.2.2引物设计使用oligo 6.0软件设计Fok Ⅰ引物：

　　Primer A: 5′AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT3′; Primer B: 5′ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC3′

　　1.2.3PCR扩增体系与反应条件PCR反应体系总体积25 μl，含模板1μl，10×PCR buffer 2.5 μl, 25 mmol/L MgCl2 1.5 μl(1.5 mmol/L), 40 mmol/L dNTP 0.5 μl(0.8 mmol/L), 上、下游引物各1.5 μl(6 pmol),5 U/μl Taq DNA 聚合酶0.25 μl(1.25 U),无菌离子水16.25 μl。PCR反应条件：94℃预变性4 min; 然后94℃变性45 s，60℃复性45 s，72℃延伸45 s，30个循环;最后再72℃延伸5 min。

　　1.2.4酶切体系及其反应条件

　　总体积10 μl,取PCR扩增产物4 μl,加入0.5 μl (5U) FokⅠ限制性内切酶及10× buffer 1 μl,无菌离子水4.5 μl。在37℃水浴消化3 h。

　　1.2.5电泳及结果分析

　　PCR产物及酶切结果加入含有溴酚蓝染料的Loading buffer，在含有溴乙腚的2.0%的琼脂糖凝胶上用100 V的电压进行电泳。用凝胶成像分析系统分析PCR产物及FokⅠ基因型。PCR产物为一大小为265 bp的片段。酶切产物分型标准：FF型为265 bp ，为野生型;Ff型为265 bp、196 bp、69 bp，为杂合型;ff型为196 bp、69 bp，为变异型。

　　1.3统计学处理

　　数据经HardyWeinberg平衡检验后，用SPSS11.0统计软件进行统计学处理。研究人群基因型和等位基因的分布频率采用χ2检验，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1PCR产物酶切结果经限制性内切酶FokⅠ对PCR产物消化后电泳显示维生素D受体基因(VDR)存在多态性。VDR基因有2个等位基因F和f，可组合形成FF、Ff、ff 3种基因型(图1)。

　　2.2HardyWeinberg遗传平衡检验为考察资料的可靠性，进行VDR基因型分布的遗传平衡检验[9]，结果显示3组基因型均符合HardyWeinberg遗传平衡，说明3组资料具有代表性。

　　2.3维族、哈族、汉族维生素D受体基因FokⅠ基因型和等位基因的频率分布维、汉族维生素D受体基因型的分布频率差异有统计学意义(χ2=21.898，P<0.001);哈、汉族维生素D受体基因型的分布频率差异有统计学意义(χ2=14.539，P<0.001);维、哈族维生素D受体基因型的分布频率无统计学意义(χ2=4.754，P>0.05)。维、汉族等位基因分布频率差异有统计学意义(χ2=17.258，P<0.001);同样，哈、汉族等位基因频率分布差异有统计学意义(χ2=13.433，P<0.001);而维、哈族等位基因分布频率差异无统计学意义(χ2=0.576，P>0.05),见表1。表13个民族儿童基因频率和等位基因频率的比较维族实际分布(略)

　　2.4各类人群维生素D受体基因FokⅠ位点基因型频率分布

　　各类人群维生素D受体基因FokⅠ多态性频率分布各不相同，经统计分析发现维族、哈族与在人种学上属同人种的英国人、美国人[10,11]相比，其维生素D受体基因FokⅠ多态性分布频率相近，汉族与在人种学上属同人种的日本人[12]之间维生素D受体基因FokⅠ多态性分布频率也相近，而不同人种间即维、哈与汉族间维生素D受体基因FokⅠ多态性分布频率明显不同(表2)。表2各类人群维生素D受体基因Fok Ⅰ位点基因型频率分布人群例数基因型频率(略)注：与汉族比较， *P<0.05; 与维族比较， △P<0.05

　　3讨论

　　新疆是我国多民族聚居地，通过研究不同民族基因多态性，不仅有助于探索各民族的相互关系，而且对于探索某些致病基因和易感基因的分布特征、研究某些疾病的发病机制及基因水平的诊断治疗都具有重要的意义。本研究首次获得了新疆维族、哈族和汉族维生素D受体基因FokⅠ多态性的分布情况。结果显示,维族与汉族、哈族与汉族之间维生素D受体基因FokⅠ多态性及等位基因分布差异均有统计学意义，而维族与哈族之间维生素D受体基因FokⅠ多态性及等位基因分布频率尚无差异。本次研究中维族和哈族是新疆特有的少数民族，由于维族及哈族在人种学上与英国人[10]、美国人[11]、尼日利亚[13]人同属高加索人种，故其维生素D受体基因FokⅠ多态性分布频率相近，而汉族属蒙古人种，因此与上述民族、人群的维生素D受体基因Fok Ⅰ多态性分布频率明显不同，而与我国蒙古族人[8]、日本人[12]相近。我们可以发现维生素D受体基因Fok Ⅰ多态性分布频率在同人种间差异相近，而不同人种间维生素D受体基因Fok Ⅰ多态性分布频率明显不同。综上，从基因水平认识不同民族基因分布的差异，为进一步研究与其相关疾病，尤其是骨代谢性疾病的发病机制、遗传背景及对疾病的防治奠定基础和依据。

　　【参考文献】

　　[1]Zittermann A. Vitamin D in preventive medicine: are we ignoring the evidence[J].Br J Nutr, 2003,89:552572.

　　[2]张红红，胡亚卓，詹志伟，等.老年男性维生素D受体基因FokⅠ多态性与骨质疏松关系的初步研究[J].中国骨质疏松杂志，2006，12(3)：239241.

　　[3]卢华君，李海林，郝萍，等.维生素D受体基因多态性与维生素D缺乏性佝偻病易感性的研究[J].中华儿科杂志，2003，41(7)：493496.

　　[4]Chuang HY, Yu KT, Ho CK. Investigations of Vitamin D receptor polymorphism affecting workers susceptibility to lead[J].J Occup Health, 2004, 46(4):316322.

　　[5]阚秀.乳腺癌临床病理学[M].北京：北京医科大学和中国协和医科大学联合出版社，1993.1.

　　[6]Elstner E, Heber D, Koeffler HP. 20EPivitamin D3 analogs. Potent modulators of proliferation and differentiation of breast cancer cell lines in vitro[J].Adv Exp Med Boil,1996,399:53.

　　[7]李继梅，卢华君，李海林，等.阿昌族与汉族维生素D受体基因FokⅠ多态性[J].中华医学遗传学杂志，2003，20(4):315317.

　　[8]邢少姬，周立社，许秀举.蒙古族人群维生素D受体基因FokⅠ多态性[J].中华医学遗传学杂志，2006，23(2):236237.

　　[9]陈竺.医学遗传学[M].北京：人民卫生出版社，2005.121128.

　　[10]Wilkinson RJ, Llewelyn M, Toossi Z, et al. Influence of vitamin D deficiency and vitamin D receptor polymorphisms on tuberculosis among Gujarati Asians in west London: a casecontrol study[J].The Lancet, 2000, 355:618621.

　　[11]Harris SS, Eccleshall TR, Gross C, et al. The vitamin D receptor start codon polymorphism (FokⅠ) and bone mineral density in premenopausal American black and white women[J].J Bone Miner Res,1997,12:10431048.

　　[12]Arai H, Miyamoto K, Taketani Y, et al. A vitamin D receptor gene polymorphism in the translation initiation codon: effect on protein activity and relation to bone mineral density in Japanese women[J]. J Bone Miner Res,1997,12:915921.

　　[13]Fischer PR, Thacher TD, Pettifor JM. Vitamin D receptor polymorphisms and nutritional rickets in Nigerian children[J]. J Bone Miner Res, 2000, 15: 22062210.