小茴香对实验性肝纤维化大鼠细胞因子TNFα的影响

　　【摘要】 目的：研究小茴香治疗实验性肝纤维化大鼠对肿瘤坏死因子α(TNFα)的影响。方法： 80只Wistar健康大鼠随机分为5组，即正常对照组、模型组、秋水仙碱治疗组、小茴香低剂量治疗组、小茴香中剂量治疗组、小茴香高剂量治疗组。采用复合因素建立肝纤维化模型，并用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测单个核细胞分泌TNFα的水平。观察小茴香对肝纤维化大鼠细胞因子TNFα的影响。结果：经小茴香治疗后肝细胞脂肪变性程度减轻，纤维化程度好转。ELISPOT检测显示：正常对照组和模型组、模型组和治疗组分泌TNFα的细胞计数差异均有统计学意义(P<0.05);小茴香高剂量治疗组降低细胞分泌TNFα的作用高于中、低剂量治疗组(P<0.05)。结论： 小茴香低、中、高剂量治疗组均有减少TNFα的分泌，抑制大鼠肝脏炎症，改善肝脏纤维化的作用。

　　【关键词】 小茴香; 肝纤维化; ELISPOT; TNFα

　　The effect on the TNFαin CCL4induced liver fibrosis rat by the foeniculum vulgare mill

　　LIU Yuping, XU Yan, GAN Ziming, et al

　　Department of Immunology, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China

　　Abstravt: Objective： To investigate the effect on the TNFαin CCl4induced liver fibrosis rat by the foeiculum vulgare mill. Metheds： Eighty healthy Wistar rats were divided into 5 groups randomly, Normal control group, Model group, Colchicines therapeia group, foeiculum vulgare mill therapeia group (low, middle, high). Liver Fibrosis model was found on composite factor. The TNFαserected by PBMCs were measured by the method of enzyme link immunal spot (ELISPOT). Results： Morphology showed that fatty degeneration and inflammation of liver ameliorate in foeiculum vulgare mill therapeia group. The method of ELISPOT showed TNFα serected by the PBMCs were different between normal control group and model group significantly (P<0.05) and different between model group and therapy group significantly (P<0.05). To the therapy group,the high dose group reduced TNFαsignificantly compared with low and middle dose groups. Conclusion：Foeiculum vulgare mill can reduce the secretation of TNFαby PBMCs, inhibit the inflammation of rats liver and ameliorate liver fibrosis.

　　Key words: foeniculum vulgare mill; liver fibrosis ascites; ELISPOT; TNFα

　　肝纤维化(Fibrosis)是指肝脏纤维结缔组织的过度沉积,是纤维增生(Fibrogenesis,即细胞外基质合成增加)和纤维分解(Fibolysis,即细胞外基质降解)不平衡的结果。是各种慢性肝病后产生的一种共同反应。其发生机理复杂。细胞因子作为免疫调节介质在肝纤维化发生过程中起着重要作用。在肝纤维化过程中,肿瘤坏死因子(TNFα)对肝星状细胞(HSC)增生、活化以及细胞外基质(ECM)的合成、基质金属蛋白酶及其组织抑制剂的释放起重要作用。TNFα可促进肝内HSC细胞及纤维母细胞增生,并促使HSC向肌成纤维细胞(MFB)转化。肝纤维化属可逆性病变，但若进一步发展致肝小叶结构改建、假小叶和结节形成(肝硬化阶段)则不可逆。因此，阻断抑制或逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的一个十分重要的目标，但是目前尚无疗效明确的抗肝纤维化的药物。伞形科植物小茴香(Foeniculum vulgare mill) 为维吾尔医常用药材，具有抗菌、消炎、镇痛、祛风的作用。在民间也常用小茴香作为偏方治疗肝纤维化，本研究利用ELISPOT方法从单个核细胞水平来观察不同浓度小茴香对肝纤维化模型大鼠细胞因子TNFα的影响，探讨小茴香治疗肝纤维化的最佳剂量及作用机制。

　　1材料与方法

　　1.1动物Wistar大鼠80只,雄性，体重(200±20) g，由新疆医科大学实验动物中心提供。

　　1.2药品和试剂小茴香由市场购买，经处理后研磨成粉存放，临用前配制成混悬液使用。秋水仙碱为秋水仙碱粉剂,Fluka产品,上海分装;大鼠淋巴细胞分离液购于天津HAOYANG生物公司;1640培养液和大鼠肿瘤坏死因子α(TNFα)ELISPOT试剂盒购于DIACLONE公司;CO2孵箱(Heal Force公司生产);酶联免疫斑点图像分析仪(赛智创业科技有限公司生产)。

　　1.3方法

　　1.3.1造模大鼠随机分为5组，即正常对照组(10只)，模型组(14只)，秋水仙碱治疗组(14只)，小茴香低剂量治疗组(14只)，小茴香中剂量治疗组(14只)，小茴香高剂量治疗组(14只)。除正常对照组外，其余各组大鼠均腹腔注射40% CCl44石蜡油(0.3 ml/100 g)，每周2次，以10%乙醇作为唯一饮料。

　　1.3.2给药方法除正常造模外，从第5周开始，每天灌胃给予相应药物。秋水仙碱治疗组(0.2 mg·kg-1·d-1 )，小茴香低剂量治疗组(0.05 g/d)，小茴香中剂量治疗组(0.1 g/d)小茴香高剂量治疗组(0.2 g/d)灌胃，共8周。

　　1.3.3标本采集除去死亡的大鼠，12周后全部采用乙醚吸入麻醉，无菌条件下心脏采血6 ml于枸橼酸钠抗凝管内。并留取肝组织做组织切片。用Ficoll密度梯度离心法分离获得外周血中单个淋巴细胞。加入完全RPMI1640培养液(含有1%谷氨酸及10%胎牛血清)中，锥虫蓝染色计数，调整浓度至2.5×106细胞/mL。

　　1.3.4ELISPOT法检测用特性性抗体包被96孔板，4℃过夜。每孔加入100 μl稀释好的细胞悬液(含250,000活细胞)和抗原刺激物刀豆蛋白(终浓度为10 μg/ml)。设定一个阴性对照孔(加1.0×106细胞和完全RPMI1640培养液)和空白对照孔(只加完全RPMI1640培养液)，每个标本设3个重复孔;37℃，5%CO2培养箱中培养15 h。用PBS 0.1%吐温20清洗3次，加入生物素标记的抗鼠TNFα二抗，37℃密封放置90 min，再次洗板，加碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，37℃，60 min，洗板后加底物显色液显色10 min后用蒸馏水，冲洗终止显色，室温晾干。用酶联免疫斑点图像分析仪计数分析数据。

　　1.4统计学处理采用

　　SPLM软件进行统计学处理，数据以(±s)表示，采用方差分析，两两比较采用SNK法，检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1形态学观察正常肝细胞无水肿，结构清楚(图1)。造模组可见肝脏正常结构明显破坏，纤维增生显著。肝细胞肿胀明显，肝窦明显变小甚至消失。肝窦内可见大量枯否细胞;肝细胞广泛脂肪变性，大量变性肝细胞呈条索状由汇管区伸入肝小叶内，并可见点状坏死(图2)。可以看见，经过治疗后，肝细胞脂肪变性不明显，纤维增生明显减少(图3～6)。

　　2.2TNFα细胞的测定采用ELISPOT法检测单个细胞分泌TNFα的值，正常对照组和模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。秋水仙碱治疗组、小茴香低、中、高剂量治疗组和模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。秋水仙碱治疗组和小茴香低、中剂量治疗组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。小茴香高剂量治疗组和小茴香低、中剂量治疗组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。表1各组TNFα细胞计数的比较(略)注：与正常对照组比较，*P<0.05; 与模型组比较， △P<0.05; 与秋水仙碱治疗组比较， ●P<0.05; 与小茴香低剂量治疗组比较，　■P<0.05

　　3讨论

　　肝纤维化是多种慢性肝病晚期共有的组织学变化，是多种类型细胞、细胞因子产生等一系列复杂作用的结果。肿瘤坏死因子α(TNFα)是由单核巨噬细胞所产生的一种多肽，目前被认为是参与多种炎症与免疫过程的重要介质。不仅具有使肿瘤坏死化的作用，且参与抗感染、凝血、发热休克、多器官功能衰竭和恶病质等多种病理生理过程。在肝损伤和炎症反应中，TNFα既可促进炎症反应，又可促进间质细胞的增殖分化和细胞外基质(ECM)合成，体内大量TNFα释放可能参与肝脏的损伤修复循环，最终引起肝脏大量ECM的合成与沉积，从而导致肝纤维化或肝硬化[1]。随着肝纤维化发病机制的逐渐阐明, 抗肝纤维化研究日益活跃。国内外有关抗肝纤维化药物治疗处于实验阶段。总的来看, 秋水仙碱、D青霉胺和己酮可可碱等西药疗效还不够肯定, 副作用较大。虽有报道秋水仙碱对血吸虫性肝纤维化有效, 但不良反应多。D青霉胺可阻断胶原的架桥连接, 妨碍胶原纤维的成熟, 但由于明显的毒副作用限制了其实际应用[2]。 己酮可可碱曾被认为可抑制血小板衍生生长因子, 但在动物模型中未观察到显著效果。中药在阻断、逆转肝纤维化方面有独特优势，很多研究也验证了这一点，如复方861、抗纤方、扶正化瘀方、肝炎平等经动物实验或临床研究证实都有不同程度的抗肝纤维化作用[3]。小茴香属中药，为食药两用，具有抗氧化作用,对肝细胞具有保护作用及抑制肝星状细胞活化,从而拮抗肝纤维化的发生。用小茴香治疗肝纤维化和腹水临床上有报道，但实验研究较少，且大多局限于简单的疗效观察，未深入到细胞分子水平，故该药抗纤维化的具体作用机制尚未完全阐明。本研究采用ELISA和酶联免疫斑点法(ELISPOT)来检测TNFα。ELISPOT是一种强有效的检测单个细胞分泌细胞因子和抗体的方法[4]，通过两种高亲和力的特性性抗细胞因子抗体来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况，细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰;可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的反应能力。具有有效快速、客观、灵敏度高的特点[5，6]。

　　本研究显示，经过小茴香治疗后，和造模组比较，其肝细胞肿胀，纤维增生明显减轻。小茴香低、中、高剂量治疗组和模型组比较，均有减少细胞分泌TNFα的作用(P<0.05);小茴香治疗组和秋水仙碱治疗组比较，小茴香低、中剂量治疗组差异无统计学意义，小茴香高剂量治疗组与秋水仙碱治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明小茴香高剂量治疗组抑制细胞分泌TNFα的作用最强，即抗纤维化的作用最好。说明小茴香可能具有抑制大鼠肝脏炎症，保护肝细胞的作用。有资料表明，中药小茴香具有抗氧化，清除自由基和活性氧的作用[7，8]，因此我们推测小茴香通过抑制脂质过氧化，进而抑制枯否细胞释放肿瘤坏死因子可能是其抗纤维化机制之一。本实验结果不仅在此证明了TNFα在实验性肝纤维化的发生中起重要作用,也为探索小茴香抗纤维化治疗策略提供了新的思路。

　　【参考文献】

　　[1]Paradis V， Dargere D, Vidaud M, et al. Expression of connective tissue growth factor in experimental rat and human liver fibrosis[J].Hepatology,1999,30:968976.

　　[2]Iredale JP,Benyon RC,Pickering J,et al.Mechanisms of spontaneous resolution of rat liver fibrosis[J]. Clin Invest,1998,102:538549.

　　[3]Wang JY. Modern treatment on hepatic disease: theory and progress[M]. First Edition. Shanghai: Shanghai Medical University Publishing House,1999.118120.

　　[4]Helms T, Boehm B, Asaad R, et al. Direct visualization of cytokineproducting recall antigenspecific CD4 memory T cells in healthy individuals and HIV patients [J]. J Immunology, 2000,16(97):37233732.

　　[5]Anthony DD, Lehmann PV. Tcell epitope mapping using the ELISPOT approach[J]. Methods,2003,29(3):260269.

　　[6]Lopez JA, Weilenman C, Audran R, et al. A synthetic malaria vaccine elicits a potent CD8+ and CD4- T Lymphocyte immune response in human .Implications for vaccination strategies[J].Eur J Immunology,2001,31:19891998.

　　[7]You H, Wang BE, Wang TL, et al. Proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells and effects of compound 861 on liver fibrosis.[J] .Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2000,8:7880.

　　[8]阿不都·热依木.小茴香和洋茴香对多种活性氧的清除作用比较[J].维吾尔医药,1998:138.