孕马尿中异黄酮类成分的研究

　　【摘要】 目的：分离孕马尿中的异黄酮类成分。方法：采用甲醇梯度洗脱，以柱色谱进行分离、纯化，通过光谱分析的方法鉴定化合物结构。结果：从孕马尿中分离获得2个化合物，分别为芒柄花黄素(Formononetin,Ⅰ)和鸡豆黄素(Biochanina,Ⅱ)。结论： 所得化合物均为首次从孕马尿中通过柱色谱分离方法得到。

　　【关键词】 孕马尿; 异黄酮; 成分

　　基金项目：新疆维吾尔自治区高技术研究发展计划项目(200611108)

　　Studies on isoflavones constituents of pregnancy estrogens

　　WANG Ying, GAO Xiaoli

　　Department of Pharmacy， Xinjiang Medical University, Urumqi 8300011， China

　　Abstract: Objective: To isolate isoflavones constituents in pregnant mare′s urine. Methods: Using gradient elution of methanol to column chromatography separation, purification, through spectral analysis of the structures identified. Results: Two compounds from pregnant mare′s urine, respectively formononetin (Formononetin,Ⅰ) and biochanin (Biochanina, Ⅱ) were isolated. Conclusion: The two compounds were first isolated and got by column chromatography method from pregnant mare′s urine.

　　Key words: pregnant mare′s urine; isoflavones; constituents

　　目前文献发现孕马尿中含有200余种成分[1]，主要有雌激素、孕激素、雄激素、黄酮类等成分。其中雌激素、孕激素为激素替代疗法中已经确定的活性成分，而黄酮在激素替代疗法中的作用尚未确定。目前，对雌激素、孕激素分离、纯化的研究报道较多，而对黄酮等成分的研究报道较少。异黄酮具有抗氧化作用、雌激素样作用、防癌和抗癌作用。 异黄酮的保健作用主要有改善经期及更年期不适、预防骨质疏松及乳腺癌、改善产后精神障碍。因此，对孕马尿中黄酮成分的研究有助于确定黄酮在激素替代疗法中的作用，对于结合雌激素类产品的临床应用具有十分重要的意义。为了进一步明确孕马尿中的化学成分，本研究采用甲醇梯度洗脱，以柱色谱进行分离、纯化，现报道如下。

　　1实验部分

　　1.1仪器与材料

　　X4型显微熔点测定仪(温度未校正)，红外光谱用PRESTITE21型红外光谱仪测试;核磁共振谱用UnityInova600超导核磁共振谱仪;溶剂为氘代二甲基亚砜，TMS作内标。孕马结合态混合雌激素提取物由特丰药业提供。

　　1.2孕马尿中成分的提取与分离[2，3]

　　取360 g孕马结合态混合雌激素提取物，用纯水溶解，将不溶物滤过，滤液浓缩后经柱分离，用水及10%、20%、40%、60%、80%、100%甲醇梯度洗脱[4]，得到G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7。G6、G7部分经色谱柱反复分离，得到化合物芒柄花黄素(Formononetin,Ⅰ)和鸡豆黄素(Biochanina,Ⅱ)。

　　2结构鉴定

　　芒柄花黄素(Formononetin,Ⅰ)：白色粉末，mp 257.5～257.9℃。分子式C16H12O4。IR νmax KBrcm-1：3442, 3143 , 2355，1681，1651, 1639, 1595, 1568, 1514, 1454, 1384, 1273，1246, 1178，1099, 1026, 954, 887, 808, 551。1HNMR (600MHz, DMSOd6)δH：8.34(1H，s，H2)，7.97(1H，d，J=9.0 Hz，H5)，6.94(1H，d，J=9.0，2.4 Hz，H6)，6.87(1H，d，J=2.4 Hz，H8)，7.51(1H，d，J=11.4 Hz，H2′，6′)，6.99(1H，d，J=11.4 Hz，H3′，5′)，3.79(1H，s，OCH3)。13CNMR(150MHz, DMSOd6 )δC：153.1(C2)，124.2(C3)，174.6(C4)，127.3(C5)，115.2(C6)，162.5(C7)，102.1(C8)，157.4(C9)，116.6(C10)，123.1(C1′)，130.0(C2′，C6′)，113.6(C3′，C5′)，158.9(C4′)，55.1(OCH3)。红外光谱，氢谱数据及碳谱数据与文献[5]基本一致。

　　3讨论

　　本研究采用甲醇梯度洗脱，以柱色谱进行分离、纯化，从孕马尿结合态雌激素提取物中分离鉴定出2个异黄酮类成分，分别为芒柄花素与鸡豆黄素。所得化合物均为首次从孕马尿中通过柱色谱分离方法得到，经熔点测定与对照品、HPLC色谱对照，所得分离物纯度较高，分离方法合理可行。结合雌激素中除含有10种雌激素外，还含有异黄酮等其他成分，异黄酮具有弱的雌激素样作用，但不是每种异黄酮类成分都有这种作用。孕马尿中含有异黄酮类成分，其作用对结合雌激素药效可能产生一定影响，但具体含有哪种成分还不确定，明确这些成分的具体结构，了解这些成分的药理作用，对研究孕马尿具有重要意义。为保证结合雌激素作用不受影响，必须明确这些成分在药物中的存在数量及对药效学的影响，如对药效产生拮抗作用则必须将这些成分除去。只有将这些成分分离出来，将纯化的结合雌激素与未纯化的结合雌激素进行药效学对比，才能确定这些成分对药效的影响和程度大小。本实验分离得到的芒柄花素与鸡豆黄素都具有弱的雌激素样作用，这可能是由于其与己烯雌酚结构相似的缘故。目前，对于孕马尿化学结构的研究与药理学研究相脱节，这方面的深入研究将有助于天然孕马雌激素药物的开发和应用。今后还将尝试不同的分离柱，分离方法和选择的溶剂还有待进一步深入研究。

　　【参考文献】

　　[1]Hill, Edward N, Thomas W. Pharmaceutical compositions of conjugated estrogens and methods of analyzing mixtures containing estrogenic compounds[P]. 6,855,703，20050215.

　　[2]张兰兰, 赵文军, 吴雪萍.孕马尿中甾体成分及其活性的研究现状[J].天然产物研究与开发,2003 ,15 (4)：354358.

　　[3]张兰兰，赵文军，吴雪萍. 孕马尿中甾体成分的研究[J]. 中草药，2003，34(增刊)：9293.

　　[4]赵文军, 吴雪萍.孕马结合态混合雌激素的提取方法[P].CN:ZL 01104852. 2,20010815.

　　[5]冯洁，向诚，梁鸿,等.丰城鸡血藤异黄酮类成分的研究[J].中国中药杂志，2007，3(4)：321322.