自体骨用于脊柱后路植骨融合中BMP-2、BMP-7的表达

　　【摘要】 目的: 观察自体骨用于脊柱后路融合过程中骨形态发生蛋白2-7(BMP-2、BMP-7)的表达，并探讨其在脊柱融合过程中的作用机制。方法：成年雄性新西兰大白兔36只，随机分为2组，每组18只，在兔腰椎5、6横突植入自体骨(自体骨组)、异体骨(异体骨组)制作腰椎后路融合模型。分别于第2、4、7、14、27、35天处死兔，取其融合节段标本，显微镜下观察，并用图文分析软件计算软骨生成面积和BMP-2、BMP-7阳性细胞数。结果：在脊柱后路融合模型中自体骨组、异体骨组软骨生成面积分别为(51±4)%、(40±5)%，自体骨组明显大于异体骨组(P<0.05)。脊柱融合过程中，各时间点自体骨组BMP-2、BMP-7表达均高于异体骨组，差异有统计学意义(P<0.05)。第14～27天表达达到高峰。结论：在脊柱后路植骨融合中，自体骨植骨融合质量优于异体骨，在脊柱融合异位成骨的过程中，自体骨BMP-2、BMP-7起到关键性作用。

　　【关键词】 自体骨; 脊柱融合; 基因表达

　　BMP-2 and BMP-7 gene expression in spinal posterolateral fusion of autograft

　　ZHANG Li-wen, WANG Wu-chang, JIN Ge-le, et al

　　(Department of Orthopedics, First Afiliated Hospital, Xinjiang Medical University,Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective: To investigate the role of bone morphogenetic protein (BMP) in the autograft and allograft spinal fusion.Methods: Thrty-six adult New Zealand rabbits were randomly divided into allograft group and autograft group.The rabbits were undergone L5-L6 intertransvers process fusion using autograft and allograft.The rabbits sacrificed at the 2th, 4th, 7th, 14th, 27th, 35th day after operation, and then tested using immunohistochemical observation and histological observation.Results: The process of spinal fusion, autograft group showed significantly more new bone formation than allograft group (P<0.05). Expressions of BMP-2 and BMP-7 in autograft group were significantly superior to allograft group.Conclusion: The degree of fusion in the posterolateral lumbar, autograft were superior to allograft.BMP-2 and BMP-7 play an important role in the spinal fusion.

　　Key words: autograft; spinal fusion; gene expression

　　在脊柱融合过程中，自体骨移植融合效果较好，但取骨量有限,并且额外增加手术风险。异体骨来源广泛，但有免疫排斥及传染疾病的危险，并且移植效果欠佳。骨形态发生蛋白(BMP)是唯一能够诱导异位成骨的转移生长因子，其生物效应为诱导间充质细胞分化为成骨细胞，通过钙盐沉积而产生新骨。无论在原位还是在异位BMP都将发挥决定性作用，没有BMP存在就不能成骨[1]。BMP-2、BMP-7是BMPS家族中成骨作用较强的生物因子，在脊柱融合中起关键的成骨作用[2]。兔是和人类腰椎生理结构相似的最小动物[3]，本研究通过已成熟的兔脊柱后路融合模型，同时植入自体骨及异体骨，观察并比较不同时期自体骨和异体骨组BMP-2、BMP-7的动态表达，检测BMP-2、BMP-7在自体骨及异体骨脊柱融合模型中的表达差异，探讨BMP-2、BMP-7在脊柱融合过程中的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 成年雄性新西兰大白兔36只，体重2.5～3.2 g(由新疆医科大学动物中心提供)，随机分为自体骨组和异体骨组，每组18只。

　　1.2 方法 采用Boden推荐方法制备兔腰椎横突间植骨融合模型，自体骨组植入自体髂骨条，异体骨组植入已制备好的异体髂骨条(每侧0.5 g)。术前3 d用硫代硫化钠术区脱毛，氯胺酮耳缘静脉注射麻醉，俯卧位固定。术前用20万单位青霉素肌肉注射，2%的碘伏消毒术区。自体骨组：后正中切口，取双侧髂骨约2.0 cm×1.5 cm大小，切割制备成1 mm×1.5 mm×15 mm单面皮质骨骨条，再沿双侧腰背筋膜纵向切开，由双侧最长肌及多裂肌间隙显露腰5、6双侧横突，去皮质化后严格止血，于双侧横突间植入，肌肉覆盖固定，逐层缝合切口。异体骨组：手术方法与自体骨相同，植入同种异体髂骨,取同种异体髂骨，切割制备成1 mm×1.5 mm×15 mm单面皮质骨骨条，清洗,1∶1氯仿-甲醇溶液脱脂，双氧水脱蛋白，盐酸表面脱钙后低温冻干。分装成18份，密封真空包装，60Co照射消毒20 kGy。术后分笼饲养。术后1～3 d每天以20万单位青霉素1日1次肌注,分别在术后第2、4、7、14、27、35天处死兔，每组每次处死3只。将融合节段取出，选取植骨融合中间作为取材部位，将植骨部位和周围组织一起取材，取材后立即置于10%甲醛溶液，于4℃固定24 h，经5%乙二胺四乙酸纳脱钙2周，每3天更换脱钙液1次。脱钙后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm连续切片，常规HE染色。采用通用二步法进行免疫组织化学染色，第35天标本切片染色后，显微镜下观察，并用图像分析系统计算软骨生成面积。对免疫组化切片在显微镜下定位，随机选取5个高倍镜视野计算BMP-2、BMP-7阳性细胞数目。

　　1.4 统计学处理 采用PEMS统计软件进行统计数据处理，采用成组t检验，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 自体骨及异体骨不同时间点阳性细胞数比较 在各时间点，自体骨组BMP-2、BMP-7表达均要高于异体骨组,差异有统计学意义(P<0.05)。且自体骨组BMP-2表达在第27天时达到高峰，BMP-7表达在第14～27天时达到高峰(表1)。

　　2.2 自体骨、异体骨软骨生成面积比较 在第35天时，自体骨组和异体骨组软骨生成面积分别为(51±4)%、(40±5)%，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。

　　表1 自体骨及异体骨不同时间点阳性细胞数比较(略)

　　3 讨论

　　腰椎疾患是骨科常见病，治疗腰椎疾患的主要目的是获得腰椎的稳定性。后路腰椎融合术是脊柱外科常用的手术方式，在缺乏生理负荷和遭受医源性软组织损伤的情况下，传统的腰椎侧后方融合要求穿过两横突间间隙的骨桥形成来联结椎体以达到融合目的[4]。Spinella等[5]报道，临床自体骨用于腰椎侧后方融合失败率为18%～55%，并且自体骨量有限，易引起取骨区麻木、疼痛等并发症，增加了手术时间及治疗费用，使自体骨的应用受到限制。异体骨来源广泛，可以部分缓解植骨材料的缺乏，随着异体骨在临床上广泛使用，人们注意到异体骨也会带来各种并发症。这些并发症的后果 ,轻则影响愈合 ,重则导致治疗的失败,主要是免疫排斥、晚期深部感染和异体骨骨折,这些并发症使异体骨的使用受到限制。

　　1965年，Urist在脱钙骨基质中发现BMP，它具有独特的诱导成骨能力，生物因素在植骨愈合过程中的重要作用受到重视。BMP属于转化生长因子β(TGF-β) 超家族成员，是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白。BMP 是唯一能够诱导异位成骨的因子，BMP 可作用于未分化间充质细胞等靶细胞,促进其向成骨细胞方向转化，从而促进植骨融合，BMP-2、BMP-7是成骨作用最强的生物因子之一。自体骨在脊柱融合过程中明显优于异体骨，用免疫组织化学的方法检测不同时间点BMP-2、BMP-7在脊柱植骨融合过程中的表达，对比二者在自体骨、异体骨植骨融合过程中的表达差异，明确生物因素在脊柱融合过程中的作用有重要意义。

　　本实验结果表明在脊柱融合过程中第35天自体骨组骨生成面积要明显高于异体骨组(P<0.05)，说明在植骨融合过程中第35天，自体骨组新生骨的质和量都要优于异体骨组。在兔脊柱横突间植骨融合各阶段，自体骨组BMP-2的表达在各时间点均高于异体骨组(P<0.05)，并且在第7、14、27天持续增高，第14～27天达到表达高峰，第35天时，表达有降低，但仍然高于异体骨组。BMP-7表达，自体骨组在各不同时间点均要高于异体骨组，在第27天时表达达到高峰，在自体骨组，BMP-2及BMP-7阳性表达细胞出现数量明显高于异体骨组。

　　在脊柱融合过程中，植入材料主要表现骨传导、骨诱导、成骨效应三方面。自体骨内有活性的生物因子及具有成骨作用的细胞未经破坏,在植骨融合过程中表现良好骨传导、骨诱导及成骨效应。同种异体骨经处理后,消除其抗原性,生物活性物质全部去除,仅保留矿物质支架，也就不具有自身成骨能力,同种异体骨移植的愈合主要是依靠骨传导作用。

　　通过上述结果证实，在脊柱融合过程中，自体骨组融合率要明显高于异体骨组，自体骨组在脊柱融合的过程中BMP-2及BMP-7在不同时间点均要高于异体骨组，说明在脊柱融合过程中BMP-2及BMP-7起到了重要作用,证实了BMP高效成骨效应,其具体作用有待进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]Mundy GR.Regulation of bone formation by bone morphogonic proten and other growth factors[J].Clin Orthopaedic Rel Res,1996,323:24-28.

　　[2]Deckers MML,van Bezooijen RL,van der Horst G, et al.Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derrived vascular endothelial growth factor A[J].Endocrinology,2002,143:1545.

　　[3]张 滨, 闫景龙.骨形态发生蛋白在微小颗粒骨诱导成骨过程中的表达[J].中国矫形外科杂志,2004,12(16)1247-1250.

　　[4]Sandha HS,Khan SN.Animal model for preclinical assessment of bone mophogenetic proteins in the spiane[J].Spine,2002,27:32-38.

　　[5][JP2]Spinella JS, Roman S, Faucheu C, et al.Opposite effects of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-1 on osteoblast differentiation[J].Bone, 2001, 29(4):323-330.