新疆地区汉族和维吾尔族人群感染幽门螺杆菌cagA分布特征及与胃相关性疾病的关系

　　【摘要】 目的： 探讨新疆地区汉族和维吾尔族慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胃溃疡、胃癌患者感染幽门螺杆菌(H.pylori)细胞毒素相关基因(cagA)的分布特征及与胃相关性疾病的关系。方法：从92例胃相关性疾病的患者(汉族46例、维吾尔族46例)胃镜活检标本中分离培养H.pylori，抽提各菌株的总DNA，采用特异性引物进行PCR扩增检测H.pylori的cagA基因，并分析其分布特征及与胃相关性疾病的关系。结果：92株H.pylori菌株中 cagA基因的检出率为84.8%，在所研究的4种疾病中汉族和维吾尔族患者感染的H.pylori cagA基因检出率差异无统计学意义(P>0.05);汉族和维吾尔族患者4种特定疾病的H.pylori cagA基因检出率差异无统计学意义(P>0.05)。 结论：新疆地区汉族和维吾尔族间H.pylori cagA基因阳性率未见明显差异，特定胃相关性疾病间H.pylori cagA基因阳性率也未见明显差异。

　　【关键词】 幽门螺杆菌; cagA基因; 聚合酶链反应

　　基金项目：新疆维吾尔自治区科技厅自然科学基金资助项目(200521109)

　　The characters and relationship between the cagA distribution of helicobacter pylori to gastric diseases among the Uygur and Han populations in Xinjiang

　　XU Hai-feng，WANG Ya-nan，Buhailiqiemu·Wufuer，et al

　　(Department of Microbiology, College of Preclinical Medicine, Xinjiang Medical University，Urumqi 830000，China)

　　Abstract： Objective： To investigate the prevalence of cytotoxin associated gene ( cagA) of Helicobacter pylori (H.pylori) in patients with upper gastroic disease among the Uygur and Han populations in Xinjiang area and to assess the relationship between cagA and H.pylori related gastrointestinal disease.Methods： Totally 92 H.pylori strains were isolated from patients with chronic gastroic disease in Xinjiang.Bacterial DNA from all these strains was extracted.The prevalence and genetic diversity in cagA sequence were studied by the technique of polymerase chain reaction (PCR).Results：　In Xinjiang area，H.pylori cagA positive rate was 84.8% (78/92)，There was no significantly difference in cagA gene between Han population and Uygur population (P>0.05) and there was no significantly difference in cagA gene between different gastric diseases (P>0.05). Conclusion：　 Positive rate of cagA was not significantly different between special Han population and Uygur population and between special chronic gastric diseases in Xinjiang area.

　　Key words: 　helicobacter pylori; cagA; PCR

　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori) 感染约占世界人口的50% , 是世界上最常见的慢性细菌感染之一，H.pylori感染是导致慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要致病因素，与胃癌的发生密切相关[1]。感染H.pylori后出现不同临床转归的原因尚不清楚，除了宿主和环境因素外, 菌株不同是不可忽视的因素之一。细胞毒素相关蛋白A (CagA) 是由H.pylori相应的cagA 基因编码产生的一种外膜蛋白,是H.pylori的重要致病因子，H.pylori基因型存在地域和民族的差异[2～4]。为了解新疆地区汉族和维吾尔族人群H.pylori cagA基因的分布及与胃相关性疾病的关系，我们从新疆地区汉族和维吾尔族慢性胃炎、胃溃疡及胃癌患者中分离培养H.pylori菌株共92株,抽提各菌株总DNA, 用特异性引物对各菌株cagA基因行PCR检测, 探讨cagA基因在新疆地区汉族和维吾尔族H.pylori相关性胃疾病患者中的分布及与不同的H.pylori相关性胃疾病的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源 分离的92例H.pylori菌株来自于2006～2007年在新疆维吾尔自治区人民医院接受胃镜检查的胃相关疾病患者，其中男性55例，女性37例，年龄18～83岁，平均49.7岁。其中慢性浅表性胃炎35例(汉族21例、维吾尔族14例)、慢性萎缩性胃炎33例(汉族14例、维吾尔族19例)、胃溃疡13例(汉族7例、维吾尔族6例)和胃癌11例(汉族4例、维吾尔族7例)，均为经胃镜和病理学检查确诊病例。

　　1.2 主要仪器与试剂 PCR扩增仪Mycycler和凝胶成像仪(美国BIO-RAD 公司)，PCR扩增试剂盒、DNA Marker(上海生工生物工程技术服务有限公司)，二氧化碳产气袋和培养盒(北京金源公司)。标准菌株NCTC11639(cagA基因阳性)由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所惠赠。

　　1.3 方法

　　1.3.1 H.pylori 菌株分离培养 92例患者分别取胃窦和胃黏膜标本各1块，放入H.pylori转送培养基中，6 h内接种于含有5%羊红细胞的哥伦比亚琼脂平板培养基中(含万古霉素10 mg/L)，在微氧环境(10% O2、5% CO2、85% N2)中、恒温培养箱37℃培养3～7 d，挑取其中无色针尖大小的菌落进行纯培养，培养所得菌落经革兰氏染色、尿素酶试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验和H.pylori通用型引物ure-a检测鉴定为H.pylori菌株。挑取菌落于保存液中-70℃保存备用。

　　1.3.2 H.pylori 基因组DNA的提取 取上述冻存菌株离心后弃去上清，加入200 μl TE无水乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤两次，待沉淀微干后溶于100 μl TE缓冲液中，-20℃保存备用。

　　1.3.3 引物设计和合成 cagA 基因引物[1]正向序列： 5′-AATACACCAACGCCTCCAAG-3′，引物反向序列：5′-TTGTTGCCGCTTTTGCTCTC-3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增片段大小为400 bp。

　　1.3.4 PCR 扩增反应 反应体系:PCR反应总体积25 μl,其中10×反应缓冲液2.5 μl, 20 mmol/L dNTP 2.5 μl，25 mmol/L MgCl2 1.5 μl,正向引物、反向引物各1 μl, Taq酶1 U，模板DNA 2 μl, 反应条件:95 ℃预变性5 min,再94℃ 45 s，55 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s，进行35个循环后,72℃延伸10 min。以标准菌株NCTC11639作阳性对照。

　　1.3.5 基因型检测 取PCR 扩增产物5 μl于1.4%含EB的琼脂糖凝胶电泳。电泳条件100 mV,30 min，标准分子量DNA Marker (DNA100 ladder) 作对照, 于紫外灯下观察结果。凝胶成像分析仪观察和记录结果,于400 bp 处出现荧光条带为cagA 基因阳性。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件对数据进行χ2检验和Fisher确切概率法检验，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　92例中cagA基因阳性率为84.8%，汉族慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胃溃疡和胃癌患者感染H.pylori cagA基因阳性率分别为76.2%、92.9%、85.7%、100.0%，差异无统计学意义(P>0.05);维吾尔族慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、胃溃疡和胃癌患者感染H.pylori cagA基因阳性率分别为92.9%、78.9%、83.3%、85.7%，差异无统计学意义(P>0.05)。在4种疾病的汉族和维吾尔族之间cagA基因阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

　　表1 汉族和维吾尔族 H.pylori 相关性胃疾病患者cagA基因的分布(略)

　　3 讨论

　　自1983 年Mashall 等首次从胃黏膜中分离出H.pylori以来, H.pylori 研究成为学术界的热点。1990年,Cover 等[5]发现具有空泡毒素活性的H.pylori培养液中全部可以查到相对分子量为12 800的蛋白质,它虽不直接表达毒素活性,但与毒素活性表达密切相关,可作为细胞毒性的标志,称为细胞毒素相关蛋白,即CagA。目前世界范围内对H.pylori cagA基因和CagA 与胃十二指肠疾病的关系报道结果各有差异。巴西、土耳其、哥伦比亚等国家的研究结果表明, cagA 基因存在于48%～78%的H.pylori菌株, 并认为cagA表达阳性的H.pylori为毒力菌株, 与消化性溃疡、萎缩性胃炎、胃癌发生的关系极为密切[6～9]。日本的研究结果显示, 90%的H.pylori临床分离菌株cagA呈阳性表达, 而且cagA的表达在H.pylori相关的不同胃十二指肠疾病之间未显示出明显的差异[10]，我国已有上海、北京、浙江、石家庄、沈阳、西安、香港、台湾等地研究学者针对本地H.pylori菌株cagA基因阳性率及与胃肠疾病关系的文献报道, cagA基因的检出率分别为84.8%、89.7%、99.2%、89.1%、100%、91.1%、88.9%、83%, 其阳性在不同的胃及十二指肠疾病之间没有明显的相关性[ 3，4,11～14 ]。本研究对新疆地区92株H.pylori菌株cagA 基因的检出率为84.8%,并且在疾病中的分布无显著性差异，与国内报道相一致。出现东亚与西欧的这种差异的原因可能为:(1)cagA的多样性。目前已证实cagA基因存在东亚及西方两种亚型，cagA基因的羧基端EPIYA重复序列被认为是区分东亚型和西方型的分子标记[15,16]。cagA基因3′端短序列与日本、德国十二指肠溃疡有关，长序列则与胃癌相关[17]。(2)cagA只是一种遗传标记,在欧美地区与vacA和iceA等致病基因联系紧密,在亚洲则否。例如最初发现cagA与空泡毒素相伴产生,命名为毒素相关蛋白,但经基因缺失研究发现,cagA对空泡毒素产生并不是必需的。

　　在本研究中cagA基因在汉族和维吾尔族间的分布无显著差异，表明cagA基因的分布可能主要与地域有关，而与民族无关。对于新疆地区汉族和维吾尔族之间cagA基因亚型的分布是否不同，尚需做进一步研究。

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