维药西帕依固龈液对实验性牙龈炎模型大鼠牙龈组织中NF-κB

作者：艾比拜·玉素甫, 库热西·玉努斯, 哈木拉提·吾甫尔    作者单位：新疆医科大学第一附属医院内分泌科，生物化学与分子生物学教研室，维吾尔医学系, 新疆 乌鲁木齐 830011

【关键词】  西帕依固龈液； 牙龈炎； 核因子κBp65； 环氧化酶-2

基金项目: 2002年国家科技创新计划(02CJ-15-02-13）

　　Study of the role of Uygur medicine Xipayi mouth rinse on the expression of NF-κBp65 and COX-2 in gingivitis model

　　Aibibai·Yusufu,  Kurexi·Yunusi,  Halmurat·Upur

　　(Department of Endocrinology, First Affliated Hospital, Xinjiang Medical University,  Urumqi 830011, China)

　　Abstract：Objective:  To study the role of NF-κBp65 and COX-2 in the pathogenesis of gingivitis and the effect of Xipayi mouth rinse on gingivitis at the mRNA level.Methods: Wistar rats were randomly divided into 3 groups: normal group, gingivitis model group and Xipayi mouth rinse group, and experimental gingivitis model was established in the last 2 groups by means of suturing the neck of right upper second molar of rats, high-carbohydrate diet and P.gingivalis inoculation, Wistar rats in Xipayi mouth rinse group treated with Xipayi mouth rinse while gingivitis model group treated with 0.9% sodium chloride, pathological changes were observed  under the light microscope , and the expression of NF-κBp65 and COX-2 mRNA in gingival tissue of 3 groups were examined by RT-PCR.Results: In comparision with the normal group, the epithelial cells were regenerated and a large amount of inflammation cells were infiltrated in gingivitis model group, inflammation cells were decreased and gingival tissue was healed in Xipayi mouth rinse group.In comparision with the normal group, the mRNA expression of NF-κBp65 and COX-2 increased (P<0.05) in gingivitis model group, while the expression of NF-κBp65 and COX-2 decreased (P<0.01) in Xipayi mouth rinse group.The expression of NF-κBp65 had a relation to COX-2 in gingivitis model group (P<0.05).Conclusion: The expression of NF-κBp65 related to COX-2 may take part in the pathogenesis of gingivitis and Xipayi mouth rinse can inhibit the expression of NF-κBp65 and COX-2 in gingivitis.Xipayi mouth rinse may play  role in the treatment of gingivitis in this way.

　　Key words:  Xipayi mouth rinse;   gingivitis;   NF-κB p65；   COX-2

　　核因子-κB（nuclear factor -κB，NF-κB）是普遍存在于胞浆的应激反应因子，具有多向转录调节作用，能与多种基因启动子或增强子κB位点发生特异性结合，从而启动调节炎症反应、免疫反应相关基因的转录，参与机体多种疾病的发生发展［1］。环氧化酶-2（cyclo-oxygenase-2，COX-2）为一种诱生型酶，其有两个调控区具有NF-κB的结合位点，在炎症介质、细胞因子刺激下COX-2 mRNA诱导表达明显增加，COX-2可经多种途径诱发牙周组织的免疫损伤［2］。以维药没食子(春虫秋果)为主要原料研制的西帕依固龈液治疗具有健齿固龈、清血止血、消炎和防腐之功效，被用于治疗牙周炎、牙龈炎、咽喉炎及口臭等。已有药理学研究证明其具有明显的抗菌、消炎、镇痛及清除自由基等作用［3］。本研究采用丝线结扎大鼠牙龈、高糖喂饲加牙龈卟啉单胞菌接种制备大鼠牙龈炎实验模型，应用西帕依固龈液进行干预，观察各组间大鼠牙龈组织中NF-κBp65、COX-2的表达及其相关性，以进一步探讨牙龈炎的发病机制及维药西帕依固龈液的作用机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物及分组  SPF级健康成年Wistar大鼠36只，雌雄各半，体重（270±25）g，由新疆医科大学实验动物中心提供。随机分为正常组、牙龈炎模型组、西帕依固龈液组3组，每组12只。

　　1.2  主要试剂  牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis ATCC 33277，四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室提供），西帕依固龈液（新疆奇康哈博维药有限公司生产，规格：100 ml/瓶，含没食子20 mg/ml，批号：060811），Trizol法总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自上海生工生物有限公司，其他试剂为进口或国产分析纯。

　　1.3  实验方法  牙龈炎模型组和西帕依固龈液组大鼠采用右侧上颌第二磨牙牙颈部丝线结扎、高糖喂饲加牙龈卟啉单胞菌接种的方法建立大鼠牙龈炎实验模型［4］，正常组麻醉后用手术针穿刺组织，但不结扎牙颈，常规实验室饲料和清水喂养。第2周起，西帕依固龈液组大鼠患牙局部用20　mg/ml的西帕依固龈液冲洗，每天5次，每次0.5　ml，连续1周。牙龈炎模型组大鼠患牙局部用生理盐水冲洗。造模第14天时，将每组大鼠脱颈椎处死，取右上颌第二磨牙的牙龈组织，立即加入10%甲醛溶液固定48 h以上，常规石蜡包埋，制成组织切片，HE染色后光学显微镜下观察牙龈组织的病理情况。另取一块牙龈组织于-80°保存，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测各组NF-κBp65、COX-2 mRNA的表达。采用经典Trizol法提取牙龈组织总RNA，参照逆转录试剂盒说明书进行操作，产物cDNA直接用作模板。对大鼠NF-κBp65、COX-2基因进行扩增，以β-actin为内参照。引物设计根据GenBank中大鼠COX-2 cDNA序列（NM_017232），运用Primer 5.0设计软件设计上下游引物。扩增完毕后进行琼脂糖凝胶电泳，并以Gene RulerTM 100 bp DNA ladder作为Marker，紫外灯下观察结果，并在凝胶成像仪上成像。采用Quantity One图像分析软件分析数据，获得各电泳条带的吸光度值（X），用β-actin的吸光度值（A）作为内参照，计算基因的相对表达量（X/A），进行半定量分析。

　　1.4  统计学处理  应用SPSS 10.0统计软件对数据进行处理，实验所得数据采用均数±标准差表示，采用完全随机两组比较的方差分析LSD检验，检验水准α＝0.05（双侧）。运用Pearson Correlation方法进行相关性分析。

　　2  结果

　　2.1  大体观察  正常组大鼠牙龈无充血红肿，牙龈炎模型组大鼠造模第14天时，出现牙龈明显充血红肿、龈面发亮、牙龈松软、探针出血，探针深达2mm，牙龈炎模型构建成功。西帕依固龈液组大鼠患牙局部用西帕依固龈液冲洗1周后，牙龈红肿明显减轻、出血减少。

　　2.2  各组大鼠组织病理学观察  正常组大鼠牙龈上皮基本完整，成纤维细胞排列整齐（图1）。牙龈炎模型组大鼠牙龈上皮炎性细胞（淋巴细胞、嗜中性粒细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞）浸润增多，血管扩张充血，间质水肿，牙龈上皮增生，部分顶突连接成网状（图2）。西帕依固龈液组大鼠牙龈上皮少量炎细胞浸润，毛细血管增生，成纤维细胞变成纤维母细胞，产生大量胶原，机化，提示组织修复愈合(图3)。

　　图1  正常组大鼠牙龈上皮基本完整，成纤维细胞排列整齐（×20）（略）   

　　图2  牙龈炎模型组大鼠牙龈上皮增生，炎性细胞浸润增多（×20）（略）   

　　图3  西帕依固龈液组大鼠牙龈上皮炎性细胞减少，组织修复愈合（×20）（略）

　　2.3  各组COX-2 及NF-κB p65 mRNA表达的比较  牙龈炎模型组大鼠牙龈组织COX-2表达量明显高于正常组(P＜0.05），而西帕依固龈液组大鼠牙龈组织COX-2表达量明显低于牙龈炎模型组(P＜0.01），西帕依固龈液组和正常组COX-2表达量差异无统计学意义(P>0.05）。牙龈炎模型组大鼠牙龈组织NF-κB p65表达量较正常组升高，但差异无统计学意义(P>0.05），而西帕依固龈液组大鼠牙龈组织NF-κB p65表达量明显低于牙龈炎模型组大鼠(P＜0.01），与正常组差异无统计学意义(P>0.05）（表1）。

　　表1  3组大鼠牙龈组织COX-2及NF-κB p65 mRNA表达的比较（略）

　　注：与正常组比较，△P＜0.05；与牙龈炎模型组比较，*P＜0.01

　　2.4  NF-κBp65与COX-2表达的相关性  运用Pearson 相关性分析结果显示，在牙龈炎模型组中NF-κBp65与COX-2的表达呈正相关（r=0.699，P=0.036）。

　　3  讨论
   
　　Sen等［5］最初从B淋巴细胞核提取物中检测到一种能与免疫球蛋白的κ轻链基因增强子κB序列特异性结合的核蛋白因子，称其为NF-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）。哺乳动物的NF-κB转录因子家族（又称Rel家族）包括5个成员：RelA(p65）、RelB、NF-κB1（50/p105）、NF-κB2(p52/p100）和c-Rel。Rel蛋白成员间可形成同源或异源二聚体，其中，p50、p65组成的异源二聚体是其发挥生物学功能的主要形式，它通常与其抑制蛋白IκB形成复合物，以非活性的三聚体形式存在于细胞质中，只有在受到各种活化因素的作用，如致炎细胞因子（白细胞介素1、2及肿瘤坏死因子α等）、病毒、紫外线和活性氧自由基等通过一系列信号转导级联反应，IκB经磷酸化、泛素化和蛋白体酶途径而降解，导致NF-κB复合物解体，发生核转移，调节的目的基因有炎性细胞（嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞）、细胞因子、黏附分子、急性期蛋白和可诱导的效应期酶等，进一步参与炎症反应的病理过程，在牙龈炎发生、发展中起关键作用［6］。Ambili等［7］研究发现90%慢性牙龈炎患者牙龈组织细胞核内可检测出p65、p50，而对照组仅有30%。本研究采用丝线结扎大鼠牙龈、高糖喂饲加牙龈卟啉单胞菌接种的方法制备大鼠牙龈炎实验模型，观察3组大鼠牙龈组织中NF-κBp65、COX-2的表达变化，结果发现，NF-κBp65 表达量比正常组升高，但差异无统计学意义(P>0.05），考虑为本实验中样本例数较少的缘故。此外，这并不意味着其蛋白质活性没有发生变化，而且在大鼠牙龈炎牙龈组织中NF-κB p65表达水平与COX-2阳性表达呈正相关关系，故可以推测NF-κB p65可能通过其蛋白质活性的变化来影响COX-2的表达。
   
　　环氧化酶（cyclo-oxygenase，COX）又称前列腺(Prostaglandins，PGs）内过氧化合成酶，是人体内催化花生四烯酸转变为前列腺素的限速酶，哺乳动物的COX至少有两种同源异构体：COX-1和COX-2。COX-1结构性表达于大多数细胞内，参与维持正常的生理功能。而COX-2为诱导型酶，静息状态下不表达，当细胞接受各种刺激，如生长因子、炎性细胞因子、细菌脂多糖（LPS）等后其表达大量增加，COX-2的局部表达增加与炎症有关，它经多种途径诱发牙周组织的免疫损伤。COX-2是炎症时前列腺素E2  ( Prostaglandin E2，PGE2)及一氧化氮(nitric oxide，NO）生成增加的主要原因，过量的PGE2及NO使血管扩张、通透性增加，导致黏膜充血、水肿。PGE2 是牙龈炎病理过程中的一种重要炎症介质，在炎症的牙龈组织和龈沟液中PGE2含量显著增加［8］。COX-1启动子上不含有NF-κB位点序列，而COX-2启动子上却含有2个NF-κB位点序列，可见NF-κB位点为COX-2转录激活所必需。活化的NF-κB进入细胞核内，与COX-2的启动子区域NF-κB位点相结合，促进COX-2转录。本研究结果显示在大鼠实验性牙龈炎模型组中，COX-2的表达水平比正常组明显增高(P＜0.05），且与NF-κB表达水平呈正相关，因此推测NF-κB可能通过调控炎性因子COX-2基因转录，参与牙龈炎的炎性损害过程。而西帕依固龈液能抑制牙龈炎牙龈组织中NF-κBp65和COX-2的表达，本研究结果提示，西帕依固龈液能抑制牙龈炎大鼠NF-κB p65和COX-2的表达，这可能就是其治疗牙龈炎的分子机制之一。

【参考文献】
  　　［1］ Tak PP, Firestein GS.NF κB:a key role in inflammatory diseases［J］.Clin Invest, 2001, 107:7-11.

　　［2］ Baeuerle PA, Baltimore D.IκB: a specific inhibitor of NF-κB transcription factor［J］.Science, 1988, 242:540-546.

　　［3］ 斯拉甫，努尔买买提·艾买提,阿布都热依木·玉素甫，等.维药西帕依固龈液的药理作用研究［J］.中国民族医药杂志,1999,3(5):35.

　　［4］ Keyes PH, Tordan HV.Periodontal lesion in in the Syrian hamster findings related to an infections and transmissible component［J］.Arch oral Biol, 1964, 9:377.

　　［5］ Sen R, Baltimore D.Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences ［J］.Cell, 1986, 46705 -46716.

　　［6］ Nichols TC,Fisher TH,Deliargris EN,et al.Role of nuclear factor-kappaB in inflammation, periodontitis, and atherogenesis［J］.Ann Periodontol, 2001,6(1):20-29.

　　［7］ Ambili R, Santhi WS, Janam P, et al.Expression of activated transcription factor nuclear factor-kappaB in periodontally diseased tissues［J］.J Periodontol, 2005,76(7): 1148-1153.

　　［8］ 陈铁楼,周以钧,吴织芬,等.牙周病患者牙龈组织前列腺素E2水平的研究［J］.实用口腔医学杂志,1992,8:136.