维生素C清除自由基能力3种检测方法的比较

　　【摘要】 目的：探讨3种不同方法检测维生素C清除自由基能力的差异，为选择一种有效评价抗氧化活性物质清除自由基能力的方法提供依据。方法：分别采用二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)分光光度法、Mn2+-H2O2-PAR分光光度法和羟自由基(·OH)试剂盒法对不同浓度的维生素C清除自由基(·OH、DPPH·)的能力进行比较。结果： DPPH·分光光度法、Mn2+-H2O2-PAR分光光度法、·OH试剂盒法检测0.024 mg/ml 维生素C对自由基的清除率分别为80.09%、95.00%、9.56%,自由基清除率为50%时维生素C浓度(IC50值)分别为0.005、0.013、0.200 mg/ml。结论： Mn2+-H2O2-PAR分光光度法的检测结果与DPPH·分光光度法基本一致，该方法可能可以作为评价抗氧化活性物质清除自由基能力的有效方法之一。

　　【关键词】 分光光度法; 维生素C; 自由基

　　A study to compare three detection methods of scavenging free radical effects of vitamin C

　　Ajigu·Abudurexiti，MaiErdan·Mahmut，Mahmut·Wusiman, et al

　　(Department of Pharmaceutics，College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China)

　　Abstract: Objective: To investigate the difference between three different methods of detection the ability of vitamin C to eliminate free radicals and provide an evidence for the selection of an effective evaluation of antioxidant activity on scarvenging free radicals.Methods: The scavenging radical effects of vitamin C on ·OH, DPPH· were determined and compared by Mn2+-H2O2-PAR method、DPPH· method and hydroxyl radical reagent kit method, respectively.Results: In DPPH· method, Mn2+-H2O2-PAR method and hydroxyl radical reagent kit method, the scavenging radical effects of vitamin C in the concentration of 0.024 mg/ml were 80.09%, 95.00%, 9.56%, the IC50 were 0.005，0.013，0.200 mg/ml, respectively.Conclusion: The results of Mn2+-H2O2-PAR method and DPPH· method are consistent.Mn2+-H2O2-PAR method could be used to evaluate the scavenging radical activity of antioxidants.

　　Key words: spectrophotometry; vitamin C; free radical

　　羟自由基(·OH)是一种氧化能力很强的自由基，可以使糖类、氨基酸、蛋白质、核酸和脂类等发生氧化，·OH与衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关[1]。二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)是一种稳定的有机自由基，通过检测抗氧化剂对DPPH·的清除能力可以表示其抗氧化性的强弱。维生素C(抗坏血酸)是一种有效的自由基清除剂，它通过逐级供给电子而转变成脱氢抗坏血酸，以清除·OH、DPPH·等自由基。有关测定抗氧化物对·OH清除率的方法已有一些报道[2～6]，各方法测定结果有差异，而且由于仪器特殊、操作繁琐等原因使其应用受到限制，因此对·OH检测方法及其结果进行对比研究显得尤为重要。本实验分别采用Mn2+-H2O2-PAR分光光度法[7]与·OH试剂盒法、DPPH·分光光度法对维生素C清除·OH和DPPH·的能力进行比较,以期筛选一种较好的评价抗氧化活性物质清除自由基能力的方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验仪器与试剂 S54型紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)，AB104-N电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，6173pH酸度计(上海任氏电子有限公司)，电热恒温水浴锅(北京辰安科学仪器厂,HH.S11-4)。4-(2-吡啶偶氮)-间苯二酚(PAR,日本同仁化学研究所)：准确称取0.215 2 g溶解于无水乙醇中，稀释并定容至100ml得0.01 mol/L PAR溶液作为储备液保存于冰箱中，使用时用二次蒸馏水逐级稀释。DPPH·(Sigma公司)：准确称取20 mg DPPH·用无水乙醇定容于250ml容量瓶中，得浓度为2.0×10-4 mol/L的DPPH·溶液，避光保存备用。30% H2O2、Mn(NO3)2、FeSO4·7H2O、CoSO4·7H2O、NaOH、Na2B4O7·10H2O、无水乙醇、维生素C均为分析纯，·OH试剂盒(南京建成生物工程研究所)，实验用水为二次蒸馏水。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 DPPH·分光光度法[8] 分别取2 ml 0.004～0.300 mg/ml不同浓度的维生素C于具塞试管中，加入2 ml所配置的DPPH·溶液，混合均匀，于25℃水浴中密闭静止30 min后，倒入光径为1 cm的比色皿，在517 nm处测定其吸光度Ai，同时测2 ml维生素C加2 ml乙醇的吸光度Aj, 以及2 ml DPPH· 溶液加2 ml二次蒸馏水的吸光度A0，计算维生素C对DPPH·的清除率S:S=[SX(]1-(Ai-Aj) A0[SX)]×100%。

　　1.2.2 Mn2+-H2O2-PAR分光光度法 在25 ml容量瓶中依次加入5 ml 0.2 mol/L pH10硼砂-氢氧化钠缓冲溶液、7.5 ml的8.0×10-5mol/L PAR溶液、1.0 ml的2.8×10-4 mol/L Mn2+ 溶液、10.5 ml二次蒸馏水、1.0 ml的0.1 mol/L 过氧化氢溶液，摇匀后立即在最大吸收波长500 nm处，每30秒内测定吸光度Ab，空白(缓冲溶液+PAR+Mn2+)吸光度A0，依Ab和A0差ΔA变化确定·OH的产生量。 在上述体系中，分别加入0.004～0.300 mg/ml不同浓度的维生素C 2ml，测定体系吸光度为As;计算·OH的清除率S:S=[SX(]As-Ab A0-Ab[SX)]×100%。

　　1.2.3 ·OH试剂盒法 实验操作按照试剂盒说明书进行。维生素C对·OH的清除率S按下式计算：S=[SX(]A对照-A测定 A对照[SX)]×100%。

　　2 结果

　　维生素C对·OH、DPPH·有较强的清除能力，其清除率与浓度呈现一定量效关系，随着维生素C浓度的增加，自由基清除率也增大。DPPH ·分光光度法、Mn2+-H2O2-PAR 分光光度法、·OH试剂盒法检测同浓度的维生素C对自由基清除能力有差异，维生素C浓度为0.024 mg/ml时，自由基清除率分别为80.09%、95.00%、9.56%;DPPH·分光光度法、Mn2+-H2O2-PAR分光光度法、·OH试剂盒法检测维生素C的IC50(自由基清除率为50%时维生素E的浓度)分别为0.005、0.013、0.200 mg/ml。DPPH ·分光光度法中，维生素C浓度大于0.050 mg/ml后清除率增加缓慢并趋于平稳。Mn2+-H2O2-PAR 分光光度法中，当维生素C浓度增大到0.024 mg/ml时，·OH清除率已达到了95.00%，再增大浓度，其清除率变化不明显(表1)。

　　表1 3种方法检测不同浓度维生素C对自由基清除率的比较(略)

　　注：“—”未测定

　　3 讨论

　　DPPH·分光光度法、Mn2+-H2O2-PAR 分光光度法、·OH试剂盒法测得维生素C的IC50分别为0.005、0.013、0.200 mg/ml。IC50值越小，表明抗氧化物质清除自由基能力越强，可见，维生素C清除自由基能力检测中，Mn2+-H2O2-PAR分光光度法和DPPH·分光光度法的检测结果相接近，而试剂盒法测定的清除率偏低。

　　DPPH·分光光度法是检测天然物质抗氧化活性强弱的有效方法，但DPPH·溶液为剧毒、易挥发的液体，操作时一定要注意避光和通风，与水溶性物质的反应能力较差[9]，此方法检测时间长，需要30 min,适用于乙醇、甲醇、丙酮、氯仿等有机溶剂提取物抗氧化性的研究[10]。Mn2+-H2O2-PAR分光光度法测定时间短，只需要0.5 min，适用范围广，可用于水溶性和醇溶性物质抗氧化活性的研究，能有效地排除背景干扰，操作简便。本实验结果表明，·OH试剂盒法的检测范围宽，增大样品浓度可以提高其清除率，但该方法有测定时间长、操作繁琐及检测方法的重现性差等缺点。本实验结果表明，维生素C对·OH和DPPH·均有不同程度的清除作用，浓度小于0.024 mg/ml时，Mn2+-H2O2-PAR分光光度法和DPPH·分光光度法测得维生素C对·OH和DPPH·的清除率基本上相同;0.150 mg/ml维生素C对DPPH·的清除率可达92.45%，对·OH的清除率在Mn2+-H2O2-PAR法中可达99.47%，在试剂盒法中可达39.84%;但在试剂盒法中，不断增大维生素C浓度可提高其清除率。相同浓度0.024 mg/ml的维生素C对DPPH·清除率为80.09%，对·OH的清除率为95.00%，试剂盒法结果为9.56%。

　　通过实验条件观察发现，3种方法在不同酸碱度条件下进行。Mn2+-H2O2-PAR分光光度法在碱性条件下、DPPH·分光光度法在中性条件下、而·OH试剂盒法需在酸性条件下进行检测。3种检测方法结果差异可能是由于实验条件的不同引起抗氧化活性物质清除自由基能力的表现有所不同。因此，在实际检测中，应根据被测物提取溶剂及在酸碱溶液中的稳定性选择适宜的检测方法。

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