失血性休克复苏后不同时间注射内毒素对大鼠肺损伤的影响

　　【摘要】 目的：观察失血性休克大鼠复苏后不同时期静脉注射内毒素对肺组织炎性介质的影响，探讨如延迟休克复苏后感染的发生时间能否降低急性肺损伤(ALI)的程度。方法：36只SD大鼠随机分为生理盐水组和内毒素组，2组均复制重症失血性休克模型，于休克90 min后液体复苏, 内毒素组、生理盐水组分别于复苏后2、8、16 h静脉注入内毒素(250 μg/kg体重)或等体积生理盐水，注射2 h后取材制备肺组织匀浆，检测并比较2组大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)含量，同时测定肺湿重/干重比值(W/D)。结果：内毒素组复苏后各时间点肺组织匀浆中TNF-α、IL-6含量及肺湿重/干重比值(W/D)均较生理盐水组相应时间点显著升高(P<0.05～0.01);内毒素组内于2 h各项指标明显高于8、16 h，在16 h 水平最低(P<0.01)。结论：失血性休克复苏后注射内毒素可加重大鼠ALI的程度, 延迟休克复苏后感染的发生时间，可以降低大鼠ALI的发生。

　　【关键词】 失血性休克; 内毒素; 急性肺损伤; 大鼠

　　Influence of acute lung injury induced by lipopolysaccharide at different periods after resuscitation in hemorrhagic shock rats

　　MA Lin-jie, DUAN Shao-bin, YAO Hua, et al

　　(Department of General Surgery, Afiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China)

　　Abstract：Objective： To observe the effect of inflammatory mediator in lung of rat which injected by lipopolysaccharide (LPS) after hemorrhagic shock (HS) at different periods，and explore weather decreased acute lung injusy (ALI) which postpone infection after resuscitation in hemorrhagic shock rats, therefore provide a potential way of treating ALI induced by HS in clinical practice.Methods: Thirty-six SD rats were randomly divided into two groups，normal saline group and astragalus mongholicus group with 18 animals in each group.The model of hemorrhagic shock was reproduced in each group and transfusion at 90 minutes after shock，injection of LPS (250 μg/kg) or normal saline in both group at 2 h，8 h，16 h respectively after resuscitation，rats were sacrificed and the lung was harvested and homonenized for the determination of tumor necrosis factor-a (TNF-a)，interleukin- 6 (IL-6) and measure values of wet-to-dry lung weight ratio (W/D) at 2 h after injection of LPS or normal saline.Results: The contents of TNF-a，IL-6 in lung homogenate and W/D in each group of astragalus mongholicus were higher than normal saline group at the same time points (P<0.05～0.01)，and 2 h were significantly higher than 8 h and 16 h in astragalus mongholicus group (P<0.01).Conclusions: Injection of LPS aggravate ALI and postpone infection after resuscitation in hemorrhagic shock decreased the degree of ALI.

　　Key words: hemorrhagic shock; LPS; acute lung injury; rat

　　急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是临床上常见的危重性疾病，起病急骤，发展迅速，病情凶险顽固，进一步可发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)，病死率高达40%～60%[1]。失血性休克(hemorrhagic shock,HS)是临床常见的危重症之一，机体在休克时，细菌和内毒素进入体内，刺激单核巨噬细胞合成并释放大量的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)等炎性细胞因子[2]，引起全身性炎症反应综合征(SIRS)。尤其是可能发生ALI，常常导致ARDS和多器官功能障碍综合征(MODS)等严重后果。内毒素是革兰氏阴性细菌(GNB)致机体ALI的主要致病物质，内毒素引起SIRS，肺为最敏感、最易受损、最早受损的器官[3]。本实验建立大鼠失血性休克复苏模型，于不同时间段注射内毒素来观察是否会导致ALI，以及ALI的程度是否一致，为临床治疗失血性休克提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 SD清洁级健康大鼠36只，雌雄不拘，体重250～300 g(由新疆医科大学实验动物中心提供)。随机分为生理盐水组(n=18)和内毒素组(n=18)[4]。

　　1.2 失血性休克复苏大鼠模型复制 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/kg)麻醉后，右侧颈总动脉插管用于放血和监测血压，尾静脉置管用于给药和复苏,2组大鼠血压稳定10 min后，经尾静脉注入肝素500 U，开放颈总动脉导管，10 min内放血至平均动脉压(MAP)35 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，维持休克状态90 min，期间若MAP超过40 mmHg则放出部分血液，若MAP低于30 mmHg则回输部分失血。维持休克状态90 min后回输全部失血并补2倍量的林格氏液进行复苏，复苏时间为60 min，观察回输后血压情况。内毒素组分别于复苏后2、8、16 h不同时相将内毒素按250 μg/kg体重(溶于无菌生理盐水)经大鼠尾静脉注入。生理盐水组分别于不同时相注射等体积无菌生理盐水。术后自由活动，禁食，自由饮水。

　　1.3 样本采集及指标测定 模型制备注射内毒素或无菌生理盐水2h后取材。腹腔麻醉，仰卧位，胸部去毛，消毒开胸，无菌剪剪开胸腔，取左肺组织0.8～0.9 g，加9倍的4℃无菌生理盐水，低温制备体积分数为10%的组织匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液置于-80℃冰箱内冷冻待测。同时取右肺，剔除结缔组织，滤纸吸干表面渗液及血迹。称湿重后置于80℃的烤箱中烘烤48h至衡重，称干重，计算肺湿重/干重比值(W/D)。分别采用大鼠TNF-α、IL-6酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(美国Sigma公司)测定肺组织匀浆液中TNF-α、IL-6含量，严格按照说明书要求进行测定。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，所有数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用两组独立样本资料的t检验，组内比较采用完全随机设计资料的方差分析，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　生理盐水组与复苏2 h时比较，复苏8、16 h时肺组织匀浆中TNF-α、IL-6含量明显升高(P<0.05～0.01)，以8 h升高辐度最大，16 h下降,但仍高于2 h(P<0.05)。内毒素组与复苏2　h时比较，复苏8、16 h肺组织匀浆中TNF-α、IL-6含量明显下降，以16 h最低(P<0.05～0.01)。和生理盐水组比较，内毒素组在复苏后2、8、16 h TNF-α、IL-6含量均明显高于相应生理盐水组(P<0.05)。生理盐水组复苏后8 h W/D明显高于复苏2 h时(P<0.01);内毒素组复苏后8、16 h W/D明显低于2 h时(P<0.05～0.01)，W/D明显高于生理盐水组各相应时间点(P<0.01)(表1)。

　　表1 2组不同复苏时间肺组织匀浆中TNF-α、IL-6含量和肺W/D的变化(略)

　　注：与生理盐水组相应时间点比较, △P<0.05, △△P<0.01; 与复苏后2 h比较, ▲P<0.05，▲▲P<0.01

　　3 讨论

　　机体在休克时因缺血、缺氧导致肠粘膜屏障功能的损害，使得胃肠粘膜通透性增强，肠道内的GNB和及其内毒素进入体内，激活单核-巨噬细胞及中性粒细胞，活化细胞内信号转导通路，诱导大量炎症介质和细胞因子合成和释放，从而引发ALI。机体在休克复苏后，重新得到血供的肠道粘膜组织会经历一个缺血-再灌注过程，产生氧自由基，造成组织损伤，进一步损害肠屏障功能，导致肠道内毒素易位。近年来研究表明肠道是失血性休克所致缺血再灌注损伤最早受累的器官之一。

　　内毒素可直接和间接地损伤血管内皮细胞，影响微血管通透性[5，6]，因而肺部微血管通透性是评价肺部炎症反应和肺损伤的一个重要指标。本实验以肺组织匀浆中TNF-α、IL-6含量以及肺W/D比值来评价肺部微血管通透性，并以此来说明ALI的程度。

　　Nwariaku 等[7]认为，休克的发生可增强肺泡巨噬细胞对脂多糖的反应性，使之易于受刺激而合成和释放TNF-α、IL-6、IL-8等细胞因子，从而加重ALI。针对机体发生失血性休克后常伴有内源性内毒素血症，Deitch[8]提出了“二次打击”假说，认为机体在受到任何一种损伤后往往处于一种致敏状态，任何一种继发性损伤，即使作用轻微，但只要超过宿主的清除能力，则可引起一系列放大的连锁反应，加重器官功能受损。已有研究证实：失血性休克增加了机体对内毒素的致敏作用，可能使体内单核-巨噬细胞系统、中性粒细胞等处于致敏状态，随着休克后大量内毒素进入体内，则使休克致敏的细胞进一步激活，产生一种明显放大的炎症反应[5]。

　　本实验结果表明，失血性休克合并内毒素致大鼠肺组织匀浆中TNF-α、IL-6含量较单纯失血性休克大鼠明显升高，肺组织损伤严重，W/D比值增大，提示双重打击后机体清除肺间质和肺泡腔过多水分的能力明显减弱，肺泡-毛细血管膜水通透性显著降低，肺组织含水量明显增加。结果提示失血性休克在液体复苏后，随着肠道黏膜屏障功能的逐步恢复，机体对内毒素的致敏作用逐渐减弱，炎症的放大反应变的不明显;同时由于失血后宿主清除内毒素能力障碍是网状内皮系统受抑制的结果，休克复苏后网状内皮系统受抑制的作用逐渐减弱，机体清除内毒素的能力逐步得到恢复。如果延迟二次打击的时间，机体抗御二次打击的能力将明显增强，肺清除间质和肺泡腔过多水分的能力将会明显改善，与此相应肺组织含水量也明显减少，ALI的程度将会减轻。

　　综上所述，失血性休克合并内毒素致大鼠肺损伤的程度可能与两次打击的间隔时间密切相关，提示对失血性休克所致肺损伤的患者如能早期有效控制继发感染无疑将有助于肺泡腔和肺间质水肿液的吸收，减轻肺水肿和肺损伤的发生，可能有利于改善失血性休克患者的预后。

　　【参考文献】

　　[1]Michael AM，Guy AZ，Charles E，et al.Future research directions in acute lung injury summary of a national heart lung and blood institute working groop[J].Am J Respir Crit Care Med，2003，167(7)：1027-1035.

　　[2]李新甫，汪建新.内毒素与急性肺损伤[J].军医进修学院学报，2005，26(6)：484-485.

　　[3]Nagase T,UozumiN,Tshii S，et al.Acute lung injury by sepsisandacid aspiration：akeroleforcytosolicphospholiaseA2[J].Nat Immunol，2000，(1)：42-46.

　　[4]方积乾，孙振球.卫生统计学[M].北京：人民卫生出版社，2005.131-133.

　　[5]Mileski WJ, Winn RK, Harlan JM, et al.Sensitivity to endotoxin in rabbits is incresed after hemorrhagic shock[J].J Appl Phsiol, 1992, 73(3)：1146-1149.

　　[6]Haimovitz-Friedman A，Cordon-Cardo C，Bayoumy S，et al.Lipopolysaccharide induces disseminated endothelial apoptosis requiring ceramide generation[J].Exp Med，1997，186：1831-1841.

　　[7]Nwariaku FE,Mclntyre KL，Sikes PJ，et al.Alterations in alveolar macrophage tumor necrosis factor (TNF)response following hemorrhagic shock[J].Shock，1995，4：200-203.

　　[8]Deitch EA.Multiple organ failure：Pathophysiology and potential future therap[J].Ann Surg，1992，216：117.