桑叶药材高效液相色谱指纹图谱分析

　　【摘要】 目的：建立桑叶高效液相色谱(HPLC)指纹图谱分析方法。方法：采用HPLC法对采自新疆及内地不同产地的18批桑叶建立HPLC指纹图谱，色谱条件：YMC -C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，甲醇(A)-0.4%磷酸(B),水溶液梯度洗脱[0～10 min，A-B比例由20∶80→25∶75;10～20 min，由25∶75→30∶70;20～50 min，由30∶70→60∶40]，流速0.8 ml/min，波长360 nm，柱温30℃。结果：从18批次桑叶药材中标示出10个共有特征峰，平均相似度为0.898。结论：该方法稳定可靠，为有效控制桑叶药材质量提供依据。

　　【关键词】 桑叶; 高效液相色谱法; 指纹图谱

　　The study of HPLC Fingerprint of folium mori

　　LIU Long, SUN Lian，YANG Wei-ju, et al

　　(College of Pharmacg, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China)

　　Abstract: Objective: To establish the chromatographic fingerprint method of Morus abla L by HPLC for the quality control.Methods: The fingerprint of 18 batches of mulberry from different areas of Xinjiang and the mainland was established by HPLC.Chromatographic conditions: with YMC-C18 column(4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used as analytical column, gradient elution 0～10 min, The ratio of A and B was: 20∶80→25∶75; 10～20 min, 25∶75→30∶70; 20-50 min, 30∶70→60∶40 was performed by mobile phase consisting of methanol-0.4% phosphoric acid water, the flow rate was 0.8 ml/min, and detection wavelength was 360nm, column temperature was 30℃.Results: Ten mutual characteristic peaks (fingerprint) were detected from 18 batches of Folium Mori, the average similarity was 0.898.Conclusion: The method is stabile and reliable, it can be used as a quality evaluation of Folium Mori.

　　Key words： mulberry leaves; RP-HPLC; fingerprint

　　桑叶为桑科植物桑Morus abla L.的干燥叶，主要含有生物碱、香豆素类、挥发油、氨基酸、有机酸类、甾体、黄酮及三萜类等化合物，具有祛风清热、清肺润燥、凉血明目的功效，是常用的中药之一[1]，《神农本草经》称桑叶为“ 神仙叶”，具有滋阴补血、疏散风热、益肝通气、降压利尿之功效。现代药理研究证明出桑叶中含有降血糖、降血脂、抗菌、抗病毒等多种药理活性物质[2～5]。

　　《中国药典》 通过采用高效液相色谱(HPLC)法测定桑叶中活性成分芦丁的含量[1]。中药及其制剂以其整体作为有效物质，常规中药的质量稳定性单靠确定已知有效成分的鉴定方法已不适应中药现代化的要求，采用色谱指纹图谱分析显示其所含的各种成分是稳定的，含量比例能保持恒定，进一步保证中药材质量和疗效的一致[6]。世界卫生组织(WHO)、美国食品和药物管理局(FDA)、英国草药典等均采用色谱指纹图谱来控制天然药物的质量 [7]。本实验采用HPLC法建立桑叶药材的指纹图谱,并对不同来源的药材进行比较,为桑叶的综合质量控制提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要仪器、试剂与药材 Water-2695HPLC仪(包括自动进样器，紫外检测器，Empower色谱工作站等);赛多利斯 BP211 型电子天平(德国);H66005超声清洗机(功率500 W及频率59 kHz，上海科导);RE52-A旋转蒸发器;芦丁(rudin，批号0080-9705)、绿原酸(chlorogenic acid，批号0861-20002)均购自中国药品生物制品检定所;甲醇(色谱纯)、磷酸为分析纯，其它试剂均为色谱纯;18批桑叶药材分别从新疆乌市5～10月、阿克苏、哈密、伊犁、吐鲁番、和田及内地陕西、四川、河北、安徽、广州、江苏等地采集，经新疆医科大学药学院生药学教研室帕丽达·阿布力孜副教授鉴定。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 对照品和供试品溶液制备 精密称取芦丁对照品3.2 mg、绿原酸对照品3.0 mg置10 ml量瓶，加甲醇定容至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。精密称取桑叶样品1.0 g(过60目筛，60℃干燥至恒重)置50 ml容量瓶中，加50%甲醇溶液30 ml，温度40℃，超声提取50 min，滤过，滤渣再用30 ml的50%甲醇，同法提取2次，合并滤液和洗涤液，减压浓缩，用甲醇溶解，置10 ml量瓶定容至度，摇匀，取上清液用(0.45 μm)微孔滤膜过滤，即为供试品溶液。

　　1.2.2 色谱条件 色谱柱：YMC-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱模式：0～10 min A-B比例由20∶80→25∶75;10～20 min由25∶75→30∶70;20～50 min由30∶70→60∶40;柱温30℃，流速0.8 ml/min，检测波长 360 nm，进样10 μl。

　　1.2.3 指纹图谱评价 采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统。首先将色谱工作站数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，对特征峰进行匹配得出桑叶样品指纹图谱的共有模式，并以共有模式为标准，对各批次样品进行整体相似度评价。

　　1.2.4 精密度实验 取同一供试品溶液连续进样5次，测定高效液相色谱图，比较各共有色谱峰的保留时间和面积，5次进样各共有峰相对保留时间相对标准偏差(RSD)为0.56%～1.10%，各共有峰相对峰面积RSD为0.20%～2.50%，符合指纹图谱研究技术的要求。

　　1.2.5 重复性实验 取同一批桑叶药材5份制备供试品溶液，测定高效液相色谱图，比较各共有色谱峰的保留时间和面积，各共有峰相对保留时间RSD为0.22%～2.00%，各共有峰相对峰面积RSD为1.2%～1.9%，符合指纹图谱研究技术的要求。

　　1.2.6 稳定性实验 取同一批供试品溶液，分别0、2、4、8、12、24 h测定高效液相色谱图，比较各共有色谱峰的保留时间和面积，各共有峰相对保留时间RSD为0.68%～1.70%，各共有峰相对峰面积RSD为0.52%～1.70%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

　　2 结果与分析

　　2.1 测定时间的确定与干扰试验 取样品溶液10 μl注入高效液相色谱仪，记录90 min内色谱图，结果表明，50 min后无有意义峰出现，故确定图谱记录时间为50 min。取50%甲醇溶液10 μl注入高效液相色谱仪，结果表明溶剂对测定无干扰。

　　2.2 样品指纹图谱建立与分析

　　2.2.1 样品测定 18批桑叶样品药材，分别按“1.2.1”项下方法制备供试溶液，按“1.2.2”项下色谱条件进样10 μl，记录高效液相色谱图(图1)。

　　图1 18批桑叶样品(S1～S18)高效液相色谱图(略)

　　2.2.2 共有峰的确定 桑叶各批次样品经高效液相色谱分离出40～50个左右的色谱峰，对不同批次供试品所得色谱峰进行分析，以芦丁、绿原酸为参照峰，选择稳定性较好、吸收强、特征明显的色谱峰作为特征指纹峰，标定出10个特征指纹色谱峰(图2)。以新疆阿克苏桑叶样品色谱图为例，以芦丁参照峰(8S)为参比，与其它9个共有指纹峰相对保留时间依次为0.229 3、0.363 3、0.403 9、0.473 9、0.623 4、0.852 3、0.957 0、1.000 0、1.359 0、1.121 8。以18批药材为样本，统计各特征峰峰面积相对含量，其中共有峰占总峰面积的80%左右，非共有峰占20%左右。

　　图2 桑叶样品HPLC共有峰色谱图(略)

　　2： 绿原酸; 8： 芦丁

　　2.2.3 相似度评价 指纹图谱相似度评价采用国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)进行计算，对各批样品进行整体相似度评价，平均相似度为0.898(表1)。

　　表1 18批次桑叶样品相似度比较(略)

　　3 结论

　　本实验采用HPLC法对桑叶进行分析，桑叶各样品HPLC指纹图谱虽存在一定差异，但均具有相同数目共有的色谱特征峰。18批桑叶药材分析结果表明，各色谱峰的保留时间匹配较好，特征峰峰面积的相对含量因样品的个体、产地、采集时间不同差异较大，该差异主要可通过各特征峰的表观丰度表达出各批次的峰面积差异。由表1可知，和田批次和乌鲁木齐两批次桑叶的相似度均较低，分别为0.752、0.784、0.787;其它批次的相似度大于0.8，平均相似度为0.898。乌市不同采集时间(5～10月)的桑叶的相似度依次递减，这可能由于化学成分随时间变化而使相似度有所差异。样品中江苏、河北、安徽、广州等地桑叶相似度差异不大，但与新疆批次桑叶之间存在微略差异。上述表明桑叶药材相似度可能与药材的产地、采集时间不同有一定的相关性。该方法稳定可靠，可为有效控制桑叶药材的质量提供科学依据。

　　【参考文献】

　　[1]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2005.209.

　　[2]Ou-Yang Z, Chen J.Research progress on chemical constituents and pharmacological activities of mulberry leaves[J].Journal of Jiangsu University (Natural Science Edition), 2003,24(6):40.

　　[3]孙 莲.桑叶的降血糖活性成分和药理作用[J].中草药,2002, 33(5):471-473.

　　[4]唐法娣.桑叶延年益寿的药理学研究[J].中草药,2000, 31(9):685-688.

　　[5]江苏新医学院.中药大辞典[M].下册.上海:上海科学技术出版社,2006.223.

　　[6]蔡宝昌,刘训红.常用中药材HPLC指纹图谱测定技术[M].北京: 化学工业出版社,2005.23.

　　[7]谢培山.色谱指纹图谱分析是中草药质量控制的可行策略[J].中药新药与临床药理,2001,12(3):141-151.