黄芪注射液对大鼠失血性休克合并内毒素所致心肌细胞凋亡的影响

　　作者：张增峰，段绍斌，姚华，马林杰，刘郁，王宏 作者单位：新疆医科大学附属中医医院普外一科, 公共卫生学院, 新疆 乌鲁木齐 830000

　　【摘要】 目的：探讨黄芪注射液对大鼠失血性休克合并内毒素所致心脏损伤心肌细胞凋亡的影响及机制。方法：雄性SD大鼠36只随机分为生理盐水组、黄芪注射液低剂量组、黄芪注射液高剂量组3组，每组12只。采用失血性休克复合内毒素打击大鼠模型的实验方法建立模型，生理盐水组由尾静脉注射采集的血液和2倍生理盐水，黄芪低、高剂量组分别由尾静脉注射采集的血液和10、20 g/kg的黄芪注射液。采用HE染色和心肌细胞凋亡的原位末端标记检测来观察黄芪注射液对心肌细胞凋亡的影响。结果：大鼠心肌损害病理形态分级显示黄芪注射液对心肌损害具有保护作用。3组大鼠心肌细胞凋亡阳性检出率为100%，2组黄芪注射液治疗组与对照组比较心肌细胞凋亡受到抑制(P<0.01)，且黄芪注射液高剂量组对心肌细胞凋亡的抑制大于黄芪注射液低剂量组(P<0.01)。结论：黄芪注射液可以抑制大鼠失血性休克合并内毒素所致心肌细胞凋亡，且黄芪注射液高剂量组优于黄芪注射液低剂量组。

　　【关键词】 黄芪注射液; 失血性休克; 内毒素; 细胞凋亡

　　Effects of Astragalus injection on apoptosis of cadiomyocyte in rate with hemorrhagic shock and endotoxin

　　ZHANG Zeng-feng，DUAN Shao-bin, YAO Hua, et al

　　(Department of General Surgery, Afiliated Traditional Chinese Medicine Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China)

　　Abstract：Objective： To study the effects of Astragalus injection on apoptosis of cadiomyocyte in rats with hemorrhagic shock and endotoxin. Methods： Thirty-six male SD rats were randomly divided into physiological saline group (n=12), low dose Astragalus injection group (n=12), high dose Astragalus injection group (n=12).Using the rat hemorrhagic shock and endotoxin attacking model, the physiological saline group was given the gathering blood and two time of physiological saline by the tail intravenous injection, the Radix Astragali low, the high dose groups was given the gathering blood and 10 g/kg, the 20 g/kg Astragalus injection by the tail intravenous injection.The apoptotic cardiomyocyte was shown by in situ end labeling method and hematoxylin method.Results： Morphologic myocardial damage in rats showed that Astragalus injection has protective effects in myocardial damaging.cardiomyocyte apoptosis positive rate in 3 groups was 100%.In Astragalus injection treatment groups, cardiomyocyte apoptosis was inhibited (P<0.01), compared with the control group, and high dose group on the inhibition of cardiomyocyte apoptosis were better than low-dose group.Conclusion： Astragalus injection has notable antagonistic effects on the cardiomyocyte apoptosis in the hemorrhagic shock and endotoxin rats, the high dose Astragalus injection is better than the low dose Astragalus injection in reducing the cardiomyocyte apoptosis.Key words： Astragalus injection; hemorrhage shock; endotoxin; apoptosis

　　失血性休克后因肠道缺血再灌注损伤使肠粘膜屏障破坏，细菌移位引起内毒素血症，也是导致多器官功能障碍综合征(MODS)的常见及主要原因。研究证实：失血性休克增加了机体对内毒素的致敏作用，可能使体内单核-巨噬细胞系统、中性粒细胞等处于致敏状态，随着休克后大量内毒素进入体内，则使休克致敏的细胞进一步激活，产生一种明显放大的炎症反应，加重器官功能受损[1]。现代药理研究表明，黄芪具有增强心肌收缩力、清除体内氧自由基、扩张血管、减少血栓形成、增加肾血流量、利尿、升高血浆白蛋白、双向调节机体免疫功能、抗病毒等多种药理作用[2]。本实验采用黄芪注射液对失血性休克合并内毒素所致心脏损伤大鼠进行复苏，以观察不同剂量黄芪注射液对心脏损伤时心肌细胞凋亡的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验试剂、动物及分组 肝素钠，粗制大肠杆菌内毒素(1×1014个死菌/L),黄芪注射液(黑龙江珍宝岛制药有限公司生产,每支10ml,相当原生药20 g，批号Z23020782 ),心肌细胞凋亡的原位末端标记(TUNEL)法检测试剂盒(北京凯基生物发展有限公司)。SD雄性大白鼠36只，体重(200±20)g，由新疆医科大学实验动物中心提供。实验前禁食12h,将大鼠随机分为生理盐水组、黄芪注射液低剂量组、黄芪注射液高剂量组，每组12只。

　　1.2 实验方法 大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔麻醉,左颈动脉置导管监测血压、放血、采集血液标本,尾静脉置导管回输血液及液体复苏,尾静脉注射500 U/kg肝素后，15 min内自颈动脉放血至平均动脉压(MAP)为(45±5) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa),维持45 min后，开始液体复苏,在2 h内生理盐水组由尾静脉注射全部采集的血液及2倍体积生理盐水，黄芪注射液低、高剂量组分别由尾静脉注射全部采集的血液和10、20 g/kg的黄芪注射液，2组黄芪注射液皆用生理盐水稀释至所采集血液量的2倍，复苏结束后由尾静脉注射1.4 mg/kg内毒素，通过血流动力学监护仪(美国Beckman Coulter公司)监测大鼠的心率、血压，2 h后取心脏，留取心肌标本。心脏标本经4%多聚甲醛固定后逐级乙醇脱水，常规石蜡包埋，于左室近心尖处，切取短轴4 μm切片数张，分别行HE、TUNEL染色,光镜下观察心肌损害的病理形态分级。采用心肌TUNEL法检测细胞凋亡指数和细胞凋亡阳性检出率。

　　1.3 结果判断标准

　　1.3.1 心肌损害病理形态分级 参照Rona等[3] 的标准分为5级：0级：心肌纤维排列整齐，横纹清晰，胞核明显，无细胞肿胀;Ⅰ级：心肌细胞混浊肿胀，间质水肿，胞核完整或稍大，横纹可不规则，部分心肌可见少量散在点状凝固性坏死，局限于心内膜下;Ⅱ级：心肌坏死呈局灶性，片状分布，灶间无连接，病变可累及心壁全层;Ⅲ 级：心肌呈片状坏死，部分坏死灶间相互连接，累及心壁全层;Ⅳ 级：可见较多融合的大片状坏死灶，累及心壁全层。

　　1.3.2 细胞凋亡指数与阳性检出率 每张切片在TUNEL阳性细胞区域随机选取5个视野进行着色细胞图像分析，凋亡心肌细胞TUNEL阳性标记表现为心肌细胞轮廓完整，胞核呈棕黄色。凋亡指数为凋亡阳性心肌细胞数占视野中全部心肌细胞数的比值。细胞凋亡阳性检出率为每组TUNEL检测阳性例数占该组的百分比。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包对数据进行分析，多组有序变量比较采用秩和检验，凋亡指数的比较采用方差分析和LSD-t检验，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 3组心肌损害病理形态分级的比较 3组皆无0级出现, 3组心肌损害程度差异有统计学意义(P<0.01),生理盐水组心肌损害较严重，黄芪注射液低、高剂量组心肌损害程度减轻(表1)。

　　2.2 心肌细胞凋亡阳性检出率及凋亡指数的比较 3组皆出现心肌细胞凋亡，阳性检出率为100%。生理盐水对照组及黄芪注射液低、高剂量组细胞凋亡指数分别为51.08±14.85、40.00±14.85、36.33±3.03，3组间差异有统计学意义(F=81.26，P<0.01)，黄芪注射液低、高剂量组凋亡指数明显低于生理盐水组(t分别为15.00、18.67，P<0.01)，高剂量组明显低于低剂量组(t=3.67，P<0.01)。

　　表1 3组心肌损害病理形态分级的比较(略)

　　3 讨论

　　失血性休克时, 因肠道细菌、内毒素的移位，常常伴发有内毒素血症的发生,且随时间的迁延，后者往往成为导致机体损伤使休克向不可逆转的方向转化的重要原因之一。针对机体发生失血性休克后常伴有内源性内毒素血症，Deitch提出了“二次打击”假说，认为机体在受到任何一种损伤后往往处于一种致敏状态，任何一种继发性损伤，即使作用轻微，但只要超过宿主的清除能力，则可引起一系列的放大的连锁反应[4]。在失血性休克并内毒素血症的过程中常伴随着心肌细胞凋亡的改变，心肌细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中所起的作用越来越引起人们的重视。本实验发现失血性休克合并内毒素所致大鼠模型出现明显的心肌细胞凋亡，说明失血性休克合并内毒素时在全身组织器官的损害过程中，心肌细胞同样存在凋亡，心肌细胞凋亡使得心肌工作细胞减少，导致心肌组织的构成失常以及心肌结构改变，最终导致心力衰竭和严重心律失常等后果的发生。

　　目前抑制心肌细胞凋亡的措施并不太多,常志文等[5]研究认为β受体阻滞剂、钙拮抗剂以及一些中药对心肌细胞凋亡具有抑制作用。近年来随着传统医学的发展,中药在心血管疾病防治中的作用越来越受到重视[6]。临床及动物实验研究表明黄芪注射液对心脏有正性肌力作用，增强心肌收缩力，增加冠状血管血流量，保护心肌细胞，改善心血管功能[7,8]。本实验结果表明黄芪注射液对心肌具有明显的保护作用，且黄芪高剂量组效果优于黄芪低剂量组。储利胜等[9]认为大剂量黄芪有正性肌力作用。孙成文等[10]通过实验发现,低剂量的黄芪总皂苷可加重心力衰竭,中剂量和高剂量有抗心力衰竭的作用，作用机理初步认为是由于黄芪抑制了心肌细胞内磷酸二酯酶(PDE)的活化剂钙调蛋白,从而抑制了PDE的活性所致[8]。黄芪注射液对失血性休克合并内毒素所致心肌细胞凋亡的影响可能与黄芪注射液抑制了心肌细胞内PDE的活化剂钙调蛋白,从而抑制了PDE的活性有关，但尚需通过实验进一步证实。

　　【参考文献】

　　[1]Mileski WJ, Winn RK, Harlan JM, et al.Sensitivity to endotoxin in rabbits is incresed after hemorrhagic shock[J].J Appl Phsiol, 1992, 73(3): 1146-1149.

　　[2]练 祥，蔡琴芳.黄芪注射液的临床应用概况[J].临床荟萃,2000，15(15):700-701.

　　[3]Rona G, Chappel CI, Blalazes T, et al.An infarct-like myocardial lesion and other toxic manifestations produced by isoproterenol in the rat[J].Arch Pathol Lab Med,1959,67:443.

　　[4]Deitch EA.Multiple organ failure: Pathophysiology and potential future therapy[J].Ann Surg, 1992, 216: 117.

　　[5]常志文,刘 琦.缺血再灌注心肌细胞凋亡及药物干预[J].中国新药杂志,2000,9(1):28-30.

　　[6]阮长武,张代富,于 萍,等.苦参碱对内皮素诱导大鼠培养心肌细胞肥大及肌球蛋白基因表达的影响[J].同济大学学报(医学版),2002,23(4):271-272.

　　[7]陈立新，廖家桢，郭维琴,等.黄芪对急性心肌梗塞患者心功能和氧自由基的影响及黄芪强心机制探讨[J].中国中西医结合杂志，1995，15(3)：141.

　　[8]雷正一，王硕仁.黄芪对心血管系统的作用[J].中国中西医结合杂志，1993，13(7)：443.

　　[9]储利胜,施雪筠,席时芳,等，黄芪皂甙提高心脏保存效果的实验研究[J].中国中西医结合杂志,1999,19(8):481.

　　[10]孙成文,雷眷利,吕文伟,等.黄芪皂苷对实验性心力衰竭的作用[J].白求恩医科大学学报，1994,20(2):125.