非小细胞肺癌凋亡指数与Bax表达的临床病理意义

　　【摘要】 目的：探讨非小细胞肺癌组织凋亡指数(AI)与Bax表达的临床病理意义。方法: 应用免疫组织化学链霉菌抗生物素-过氧化物酶(S-P)法检测46例非小细胞肺癌切除标本以及23例癌旁正常肺组织的Bax表达情况,同时应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记(TUNEL)法检测非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织AI的大小，并比较不同年龄、不同病理类型、临床分期、不同级别、淋巴结有无转移患者Bax的表达和AI的大小。结果：肺鳞癌与肺腺癌组织中Bax的阳性表达率分别为52.38%、64.00%，低于癌旁肺组织(91.30%)(P<0.05)，不同临床病理特征患者Bax的表达差异无统计学意义(P>0.05)。肺鳞癌、肺腺癌的AI为(5.67±3.11)%与(6.58±3.58)%,均低于癌旁正常肺组织(14.07±5.16)%(P<0.05)，Ⅲ～Ⅳ期患者AI高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)，而其它临床病理特征患者AI差异无统计学意义(P>0.05)。Bax阳性表达的患者AI为(6.93±2.90)%,高于Bax阴性表达的患者(5.04±3.76)%，但差异无统计学意义(P>0.05)。结论：非小细胞肺癌患者中Bax表达下调、缺失以及AI的下降可能在肿瘤的发生、发展中起一定的作用。

　　【关键词】 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记法; 非小细胞肺癌; 凋亡; Bax; 链霉菌抗生物素-过氧化物酶法

　　The clinicopathologic significance of apoptosis index in non small cell lung cancer

　　XING Peng-cheng，Maimaitiaili·Wumaer，CUI Wen-li，et al

　　(Department of Pathology, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective: To study the clinicopathologic significance of apoptosis index(AI) by TUNEL and the expression of Bax in non small cell lung cancer.Methods: The expression of Bax in forty-six resected specimens of non small cell lung cancer (NSCLC) and twenty-three non-tumor lung tissue were detected by S-P immunohistochemistry.Meanwhile,they were investigated the AI by TUNEL.Results: The positive rates of Bax in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma were significantly lower than in non-tumor lung tissue (52.38% and 64% vs 91.30%, P<0.05); The positive expression of Bax have no relationship with tumor type, differentiation, metastasis to lymph node,age and the stage of TNM (P>0.05).Meanwhile, the AI of squamous cell carcinoma and adenocarcinoma were investigated by TUNEL.It showed that both of the AI of squamous cell carcinoma and adenocarcinoma were lower than non-tumor lung tissue [(5.67±3.11)% and (6.58±3.58)% vs (14.07±5.16)% , P<0.05], but according to their different clinicopathologic feature (different type, tumor differentiation, metastasis to lymph node, age and the stage of TNM), they were grouped and compared with each other.It showed that in the patients of the stage Ⅲ～Ⅳ NSCLC were higher than that of the stage Ⅰ～Ⅱ NSCLC statistically (P<0.05).The AI of the patient with Bax positive expression was higher than that of the patient with Bax negative expression,but contrasted with each other, they had no statistic significance [(6.93±2.90)% vs (5.04±3.76)%, P>0.05].Conclusion: It perhaps had some effect on occurrence and development of NSCLC that the expression of Bax was down regulated and the AI of NSCLC decreased.

　　Key words: TUNEL; non small cell lung cancer(NSCLC); apoptosis; S-P immunohistochemistry

　　随着分子生物学的发展以及细胞凋亡与肿瘤研究的不断深入,肿瘤组织细胞凋亡指数(AI)[1]的大小对于肿瘤的发生、发展以及预后判断的意义成为人们研究的热点。但是，许多的研究报道却不尽相同，甚至得出截然相反的结论：一种认为,凋亡作为机体抑制过度生长细胞,起稳态作用,对肿瘤的发展起负作用;另一种观点则认为,凋亡淘汰某些癌变有困难的细胞,选择更具有侵袭力的细胞群,从而促进肿瘤的发展,导致肿瘤的转移[2]。

　　Bax基因是鉴定出来的第一个凋亡促进基因，与Bcl-2有40%的同源性，具有Bcl-2的保守区域BH1～BH3，但不含有BH4结构域，其表达的蛋白产物主要位于细胞质中[3]，其在肺癌组织中表达情况的研究还不多。

　　本研究通过检测非小细胞肺癌(NSCLC)中AI的大小、Bax的表达情况，以探讨它们的临床病理意义及其相互关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源 收集46例新疆医科大学第一附属院病理科2004年1月～2007年6月间胸外科肺癌患者经手术切除的标本,其中男性35例，女性11例，年龄41～80岁，平均60.78岁，≤60岁19例，>60岁27例。肺腺癌25例，肺鳞癌21例。低分化者14例，中、高分化者32例。有淋巴结转移者17例，无淋巴结转移者29例。肺癌Ⅰ～Ⅱ期患者32例，Ⅲ～Ⅳ期患者14例。同时取肺癌患者癌旁正常肺组织(镜下确认无癌细胞浸润及转移)共23例。肺癌患者临床TNM分期根据1997年UICC新修订的肺癌TNM分期标准进行划分[4，5]。

　　1.2 方法 应用免疫组织化学链霉菌抗生物素-过氧化物酶(S-P)法检测Bax在肺鳞癌和肺腺癌中的表达情况，按照S-P试剂盒使用说明书进行。Bax 鼠单克隆抗体、胃蛋白酶、超敏S-P(鼠/兔)试剂盒、DAB显色剂均购自福州迈新生物科技有限公司。Tunel POD、原位凋亡检测试剂盒购自Boeringer Mannheim。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记(TUNEL)法检测AI，常规制片，脱腊，水化，PBS冲洗。滴加胃蛋白酶(即用型)，37℃水浴恒温箱中孵育30 min，PBS冲洗。每张切片滴加0.3%H2O2 甲醇，室温下30 min，PBS冲洗。滴加新鲜鸡蛋蛋清，37℃水浴恒温箱中孵育30 min。甩去蛋清，滴加TUNEL反应液(TdT酶溶液与labeling solution的比例为1∶9)，37℃水浴恒温箱中孵育90 min，PBS冲洗。滴加用PBS液1∶2稀释的抗荧光素-过氧化物酶溶液，37℃水浴恒温箱中孵育30 min，PBS液冲洗，之后每张切片滴加新鲜配置的DAB，显微镜下观察显色情况，流水冲洗及时中止显色。苏木素复染，盐酸酒精封化，返蓝，脱水，透明，风干，中性树胶封片。

　　1.3 判定标准 (1)Bax表达的阳性标准为棕黄色颗粒，定位于细胞浆内[6]。无阳性反应细胞、背景同空白对照者为阴性，阳性反应细胞质呈淡棕色或阳性细胞率 0～20 %者为(±)，阳性细胞浆呈棕色且阳性细胞率20%～80%者为(+)，>80%为(++)，其中阴性和(±)均判定为阴性，(+)和(++)均判定为阳性。阴性对照以PBS代替一抗，阳性对照采用自身对照。(2)AI，TUNEL反应阳性为细胞核呈现棕黄色，高倍镜(40×10)下选定5～10个视野，每个视野计数100～200个细胞，总共计数约500～1 000个细胞，计算其中的凋亡细胞数所占比例[1]。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件对数据进行处理，计数资料的比较采用χ2检验，计量资料的比较采用t/t′检验，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 Bax的表达情况 Bax在肺肿瘤细胞质中以及癌旁正常肺组织支气管粘膜柱状上皮、粘膜下腺体、肺泡上皮细胞质中表达。在肺鳞癌中阳性率为52.38%，在肺腺癌中为64.00%，均低于癌旁肺组织91.30%(P<0.05)。其它临床病理特征Bax的表达情况差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

　　2.2 AI大小的比较 肺鳞癌、肺腺癌、癌旁正常肺组织AI分别为(5.64±3.11)%、(6.58±3.58)%、(14.07±5.16)%，肺鳞癌与肺腺癌AI低于癌旁正常肺组织(P<0.05)。对非小细胞肺癌不同临床病理特征AI进行分组比较，肺癌Ⅲ～Ⅳ期患者AI高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)，在不同类型、不同级别、淋巴结转移情况以及年龄等因素的分组比较中均未见有统计学差异(P>0.05)(表1)。

　　2.3 Bax表达阴性与阳性患者AI的比较 Bax表达阴性患者AI为(5.04±3.76)%，Bax表达阳性患者AI为(6.93±2.90)%，差异无统计学意义(t=1.93, P=0.060)。

　　3 讨论

　　Bax可与Bcl-2形成异二聚体或与自身形成同二聚体，当Bax在细胞内超表达时,细胞对死亡信号的反应增强,细胞死亡增多,因此被称为“死亡激动剂”。当Bcl-2超表达时,它与Bax形成异二聚体,死亡被抑制[3,6]。Bax在非小细胞肺癌中的表达各家报道不一，Caputi等[7]用免疫组化法对55 例非小细胞肺癌组织进行研究,发现非小细胞肺癌中有较高的Bax表达。而Wang等[8]应用免疫组织化学S-P法检测115例Ⅰ～Ⅱ期非小细胞肺癌组织中发现Bax蛋白的表达明显低于正常肺组织。本研究结果表明，肺鳞癌、肺腺癌中Bax的表达均低于癌旁正常肺组织，差异有统计学意义(P<0.05)，与Wang等[8]报道一致，提示Bax的表达下调、缺失在肿瘤的发生中可能起一定的作用。另外，发现腺癌Bax的表达略高于鳞癌，与Porebska等[9]的研究报道相似，但二者比较差异无统计学意义(P>0.05)。肿瘤的发生、发展是一个多因素参与、多步骤演变的复杂的过程，Hanaoka等[10]研究表明：Bax的过表达和肺癌的临床病理特征无关。本研究结果显示：不同年龄、不同分化程度、TNM分期以及淋巴结有无转移的患者Bax的表达差异无统计学意义(P>0.05)，提示Bax能否成为临床上判断肿瘤生物学行为的一个有用的指标，还有待更多的研究加以证实。

　　表1 不同临床病理特征患者Bax的表达情况及AI大小的比较(略)

　　TUNEL法特异性、敏感性强,并且可以量化凋亡细胞和动态观察凋亡细胞超微结构的变化,在凋亡研究方面具有优势[1，6]。本研究结果显示肺鳞癌与肺腺癌的AI均明显低于癌旁正常肺组织(P<0.05)，但发现肺癌Ⅲ～Ⅳ期患者AI高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异有统计学意义(P<0.05)，而其它临床病理特征患者的AI差异无统计学意义(P>0.05)，表明非小细胞肺癌组织凋亡能力的下降可促进肿瘤的发生，同时随着病程的进展、肿瘤细胞不断的增殖，AI也随之增加，提示AI的大小随着患者自身免疫力的变化以及肿瘤细胞抗凋亡能力的改变而改变，但还不能认为它是反映细胞生物学行为的一个稳定而独立的指标。

　　参与细胞凋亡是一个多因素、多步骤的复杂的网络系统，其它的凋亡抑制基因和促进基因也可能参与影响和调控着细胞的凋亡，Bax仅仅是这其中的一条途径，本研究结果显示Bax表达阳性与阴性者AI差异无统计学意义(P>0.05)，Bax与肺癌细胞的凋亡关系还有待于进一步的、更多的研究以证实。

　　【参考文献】

　　The clinicopathologic significance of apoptosis index in non small cell lung cancer

　　XING Peng-cheng，Maimaitiaili·Wumaer，CUI Wen-li，et al

　　(Department of Pathology, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective: To study the clinicopathologic significance of apoptosis index(AI) by TUNEL and the expression of Bax in non small cell lung cancer.Methods: The expression of Bax in forty-six resected specimens of non small cell lung cancer (NSCLC) and twenty-three non-tumor lung tissue were detected by S-P immunohistochemistry.Meanwhile,they were investigated the AI by TUNEL.Results: The positive rates of Bax in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma were significantly lower than in non-tumor lung tissue (52.38% and 64% vs 91.30%, P<0.05); The positive expression of Bax have no relationship with tumor type, differentiation, metastasis to lymph node,age and the stage of TNM (P>0.05).Meanwhile, the AI of squamous cell carcinoma and adenocarcinoma were investigated by TUNEL.It showed that both of the AI of squamous cell carcinoma and adenocarcinoma were lower than non-tumor lung tissue [(5.67±3.11)% and (6.58±3.58)% vs (14.07±5.16)% , P<0.05], but according to their different clinicopathologic feature (different type, tumor differentiation, metastasis to lymph node, age and the stage of TNM), they were grouped and compared with each other.It showed that in the patients of the stage Ⅲ～Ⅳ NSCLC were higher than that of the stage Ⅰ～Ⅱ NSCLC statistically (P<0.05).The AI of the patient with Bax positive expression was higher than that of the patient with Bax negative expression,but contrasted with each other, they had no statistic significance [(6.93±2.90)% vs (5.04±3.76)%, P>0.05].Conclusion: It perhaps had some effect on occurrence and development of NSCLC that the expression of Bax was down regulated and the AI of NSCLC decreased.

　　Key words: TUNEL; non small cell lung cancer(NSCLC); apoptosis; S-P immunohistochemistry

　　随着分子生物学的发展以及细胞凋亡与肿瘤研究的不断深入,肿瘤组织细胞凋亡指数(AI)[1]的大小对于肿瘤的发生、发展以及预后判断的意义成为人们研究的热点。但是，许多的研究报道却不尽相同，甚至得出截然相反的结论：一种认为,凋亡作为机体抑制过度生长细胞,起稳态作用,对肿瘤的发展起负作用;另一种观点则认为,凋亡淘汰某些癌变有困难的细胞,选择更具有侵袭力的细胞群,从而促进肿瘤的发展,导致肿瘤的转移[2]。

　　Bax基因是鉴定出来的第一个凋亡促进基因，与Bcl-2有40%的同源性，具有Bcl-2的保守区域BH1～BH3，但不含有BH4结构域，其表达的蛋白产物主要位于细胞质中[3]，其在肺癌组织中表达情况的研究还不多。

　　本研究通过检测非小细胞肺癌(NSCLC)中AI的大小、Bax的表达情况，以探讨它们的临床病理意义及其相互关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源 收集46例新疆医科大学第一附属院病理科2004年1月～2007年6月间胸外科肺癌患者经手术切除的标本,其中男性35例，女性11例，年龄41～80岁，平均60.78岁，≤60岁19例，>60岁27例。肺腺癌25例，肺鳞癌21例。低分化者14例，中、高分化者32例。有淋巴结转移者17例，无淋巴结转移者29例。肺癌Ⅰ～Ⅱ期患者32例，Ⅲ～Ⅳ期患者14例。同时取肺癌患者癌旁正常肺组织(镜下确认无癌细胞浸润及转移)共23例。肺癌患者临床TNM分期根据1997年UICC新修订的肺癌TNM分期标准进行划分[4，5]。

　　1.2 方法 应用免疫组织化学链霉菌抗生物素-过氧化物酶(S-P)法检测Bax在肺鳞癌和肺腺癌中的表达情况，按照S-P试剂盒使用说明书进行。Bax 鼠单克隆抗体、胃蛋白酶、超敏S-P(鼠/兔)试剂盒、DAB显色剂均购自福州迈新生物科技有限公司。Tunel POD、原位凋亡检测试剂盒购自Boeringer Mannheim。末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记(TUNEL)法检测AI，常规制片，脱腊，水化，PBS冲洗。滴加胃蛋白酶(即用型)，37℃水浴恒温箱中孵育30 min，PBS冲洗。每张切片滴加0.3%H2O2 甲醇，室温下30 min，PBS冲洗。滴加新鲜鸡蛋蛋清，37℃水浴恒温箱中孵育30 min。甩去蛋清，滴加TUNEL反应液(TdT酶溶液与labeling solution的比例为1∶9)，37℃水浴恒温箱中孵育90 min，PBS冲洗。滴加用PBS液1∶2稀释的抗荧光素-过氧化物酶溶液，37℃水浴恒温箱中孵育30 min，PBS液冲洗，之后每张切片滴加新鲜配置的DAB，显微镜下观察显色情况，流水冲洗及时中止显色。苏木素复染，盐酸酒精封化，返蓝，脱水，透明，风干，中性树胶封片。

　　1.3 判定标准 (1)Bax表达的阳性标准为棕黄色颗粒，定位于细胞浆内[6]。无阳性反应细胞、背景同空白对照者为阴性，阳性反应细胞质呈淡棕色或阳性细胞率 0～20 %者为(±)，阳性细胞浆呈棕色且阳性细胞率20%～80%者为(+)，>80%为(++)，其中阴性和(±)均判定为阴性，(+)和(++)均判定为阳性。阴性对照以PBS代替一抗，阳性对照采用自身对照。(2)AI，TUNEL反应阳性为细胞核呈现棕黄色，高倍镜(40×10)下选定5～10个视野，每个视野计数100～200个细胞，总共计数约500～1 000个细胞，计算其中的凋亡细胞数所占比例[1]。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件对数据进行处理，计数资料的比较采用χ2检验，计量资料的比较采用t/t′检验，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 Bax的表达情况 Bax在肺肿瘤细胞质中以及癌旁正常肺组织支气管粘膜柱状上皮、粘膜下腺体、肺泡上皮细胞质中表达。在肺鳞癌中阳性率为52.38%，在肺腺癌中为64.00%，均低于癌旁肺组织91.30%(P<0.05)。其它临床病理特征Bax的表达情况差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

　　2.2 AI大小的比较 肺鳞癌、肺腺癌、癌旁正常肺组织AI分别为(5.64±3.11)%、(6.58±3.58)%、(14.07±5.16)%，肺鳞癌与肺腺癌AI低于癌旁正常肺组织(P<0.05)。对非小细胞肺癌不同临床病理特征AI进行分组比较，肺癌Ⅲ～Ⅳ期患者AI高于Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)，在不同类型、不同级别、淋巴结转移情况以及年龄等因素的分组比较中均未见有统计学差异(P>0.05)(表1)。

　　2.3 Bax表达阴性与阳性患者AI的比较 Bax表达阴性患者AI为(5.04±3.76)%，Bax表达阳性患者AI为(6.93±2.90)%，差异无统计学意义(t=1.93, P=0.060)。

　　3 讨论

　　Bax可与Bcl-2形成异二聚体或与自身形成同二聚体，当Bax在细胞内超表达时,细胞对死亡信号的反应增强,细胞死亡增多,因此被称为“死亡激动剂”。当Bcl-2超表达时,它与Bax形成异二聚体,死亡被抑制[3,6]。Bax在非小细胞肺癌中的表达各家报道不一，Caputi等[7]用免疫组化法对55 例非小细胞肺癌组织进行研究,发现非小细胞肺癌中有较高的Bax表达。而Wang等[8]应用免疫组织化学S-P法检测115例Ⅰ～Ⅱ期非小细胞肺癌组织中发现Bax蛋白的表达明显低于正常肺组织。本研究结果表明，肺鳞癌、肺腺癌中Bax的表达均低于癌旁正常肺组织，差异有统计学意义(P<0.05)，与Wang等[8]报道一致，提示Bax的表达下调、缺失在肿瘤的发生中可能起一定的作用。另外，发现腺癌Bax的表达略高于鳞癌，与Porebska等[9]的研究报道相似，但二者比较差异无统计学意义(P>0.05)。肿瘤的发生、发展是一个多因素参与、多步骤演变的复杂的过程，Hanaoka等[10]研究表明：Bax的过表达和肺癌的临床病理特征无关。本研究结果显示：不同年龄、不同分化程度、TNM分期以及淋巴结有无转移的患者Bax的表达差异无统计学意义(P>0.05)，提示Bax能否成为临床上判断肿瘤生物学行为的一个有用的指标，还有待更多的研究加以证实。

　　表1 不同临床病理特征患者Bax的表达情况及AI大小的比较(略)

　　TUNEL法特异性、敏感性强,并且可以量化凋亡细胞和动态观察凋亡细胞超微结构的变化,在凋亡研究方面具有优势[1，6]。本研究结果显示肺鳞癌与肺腺癌的AI均明显低于癌旁正常肺组织(P<0.05)，但发现肺癌Ⅲ～Ⅳ期患者AI高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异有统计学意义(P<0.05)，而其它临床病理特征患者的AI差异无统计学意义(P>0.05)，表明非小细胞肺癌组织凋亡能力的下降可促进肿瘤的发生，同时随着病程的进展、肿瘤细胞不断的增殖，AI也随之增加，提示AI的大小随着患者自身免疫力的变化以及肿瘤细胞抗凋亡能力的改变而改变，但还不能认为它是反映细胞生物学行为的一个稳定而独立的指标。

　　参与细胞凋亡是一个多因素、多步骤的复杂的网络系统，其它的凋亡抑制基因和促进基因也可能参与影响和调控着细胞的凋亡，Bax仅仅是这其中的一条途径，本研究结果显示Bax表达阳性与阴性者AI差异无统计学意义(P>0.05)，Bax与肺癌细胞的凋亡关系还有待于进一步的、更多的研究以证实。