柴虎疏肝煎剂对肝纤维化大鼠细胞因子的影响

　　【摘要】 目的：观察柴虎疏肝煎剂(丹参、三棱、虎杖、柴胡、香附各12 g)对肝纤维化大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(INF-γ)的影响。方法：80只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、中药金三莪预防组、柴虎疏肝煎剂预防组、中药金三莪治疗组、柴虎疏肝煎剂低、中、高剂量治疗组，共8组，每组10只。除正常对照组以外，其余各组以40%四氯化碳石蜡油进行造模，造模同时中药金三莪预防组和柴虎疏肝煎剂预防组分别给予中药金三莪0.6 g/100 g体重和柴虎疏肝煎剂1 g/100 g体重。治疗组从造模4周后灌胃治疗。正常对照组和模型对照组分别给予生理盐水1 g/100 g体重，中药金三莪治疗组给予中药金三莪0.6 g/100 g体重，柴虎疏肝煎剂低、中、高剂量治疗组分别给予柴虎疏肝煎剂0.5、1.0、2.0 g/100 g体重。利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组大鼠血清中TNF-α和INF-γ的水平。结果：模型对照组大鼠血清中TNF-α水平明显高于正常对照组(P<0.01)，金三莪预防组、治疗组大鼠血清中TNF-α水平与模型对照组相比明显降低(P<0.05～0.01)，柴虎疏肝煎剂预防组及柴虎疏肝煎剂低、中、高剂量治疗组大鼠血清中TNF-α水平均低于模型对照组(P<0.05～0.01)，柴虎疏肝煎剂高剂量治疗组大鼠血清中TNF-α水平明显低于柴虎疏肝煎剂低剂量治疗组、预防组(P<0.05)。模型组对照组大鼠血清中IFN-γ水平明显高于正常对照组(P<0.01)，柴虎疏肝煎剂中、高剂量治疗组血清IFN-γ水平较模型对照组明显降低(P<0.01)，柴虎疏肝煎剂高剂量治疗组大鼠血清中IFN-γ水平明显低于柴虎疏肝煎剂低剂量治疗组、预防组(P<0.05)。结论：柴虎疏肝煎剂可明显降低血清中IFN-γ和TNF-α的水平，是否能通过降低血清中这两类细胞因子的水平来起到治疗肝纤维化的作用有待进一步研究。

　　【关键词】 肝纤维化; 肿瘤坏死因子-α; 干扰素-γ; 柴虎疏肝煎剂

　　Effect of ChaiHu ShuGan decoction on cytokines of rats with hepatic fibrosis

　　WANG Fu-xin，DING Jian-bing，XU Yan，et al

　　(Department of Immunology，College of Preclinical Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective: To observe the effect of(Saliva, Bupleuri, sparganii, giant knotweed rhizome, nutgrass galingale rhizome)constitute ChaiHu ShuGan decoction on tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interferon-γ(INF-γ) in serum of rats with hepatic fibrosis.Methods: The eighty rats were divided into eight groups randomly，every group included ten rats.They were control group, model group, traditional Chinese Drugs JinSanE preventive group, ChaiHu ShuGan decoction preventive group, traditional Chinese Drugs JinSanE therapeutic group, ChaiHu ShuGan decoction low dosage, middle dosage, high dosage therapeutic group.Except control group, the other groups were given 40% carbon tetrachloride liquid paraffin to make model of hepatic fibrosis.Traditional Chinese drugs JinSanE preventive group and ChaiHu ShuGan decoction preventive group were administrated traditional Chinese drugs JinSanE and ChaiHu ShuGan decoction 0.6 g/100 g and 1.0 g/100 g respectively, when the model began to make.Four weeks later, the traditional Chinese Drugs JinSanE therapeutic groups, ChaiHu ShuGan decoction low dosage, middle dosage, high dosage therapeutic group were administrated traditional Chinese Drugs JinSanE 0.6 g/100 g, ChaiHu ShuGan decoction 0.5, 1.0, 2.0 g/100 g respectively eight weeks.The concentration of TNF-αand INF-γin the serum of rats in every group were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results: Compared with control group，the concentration of TNF-αin serum of model group increased obviously(P<0.01).Compared with model group the concentration of TNF-αin serum of JinSanE preventive group, therapeutic group decreased obviously(P<0.05～0.01).Compared with model group，the concentration of TNF-αin serum of ChaiHu ShuGan decoction preventive group decreased obviously(P<0.05). Compared with model group，the concentration of TNF-αin serum of ChaiHu ShuGan decoction low dosage, middle dosage, high dosage therapeutic group decreased obviously(P<0.05～0.01).Compared with ChaiHu ShuGan decoction low dosage therapeutic group and ChaiHu ShuGan decoction preventive group, the concentration of TNF-αin serum of ChaiHu ShuGan decoction high dosage therapeutic group decreased obviously(P<0.05).Compared with control group，the concentration of IFN-γin serum of model group increased obviously (P<0.01).Compared with model group ,the concentration of IFN-γ in serum of ChaiHu ShuGan decoction middle and high dosage therapeutic groups decreased obviously (P<0.01).Compared with ChaiHu ShuGan decoction low dosage therapeutic group, preventive group, the concentration of IFN-γin serum of ChaiHu ShuGan decoction high dosage therapeutic group decreased obviously(P<0.05).Conclusion: ChaiHu ShuGan decotion could decrease the concentration of TNF-α and INF-γin serum obviously.Could it improve hepatic fibrosis or not by decreasing these two cytokines needs further research.

　　Key word：hepatic fibrosis; TNF-α; INF-γ; ChaiHu ShuGan decoction

　　肝纤维化是由肝脏受到慢性损伤引起的细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)蛋白的堆积所致，这也是多种慢性肝脏疾病的特征[1]，ECM的堆积构成了纤维瘢痕，破坏了肝脏的结构，并形成新生肝实质细胞的结节，引起肝硬化,从而导致肝细胞的功能紊乱，严重的肝纤维化可以导致肝功能衰竭。肝纤维化的细胞和分子生物学机制研究已取得较大的进展，针对损伤、信号转导等关键步骤的靶向性治疗已经展开[2，3]，Hammel等[4]研究证实严重的肝纤维化是可以被逆转的。目前国际上主要采取西药治疗肝纤维化，但是效果不佳而且副作用大。中医可以在多水平、多靶点治疗，目前已有多种复方、单方及有效提取成分在肝纤维化治疗方面取得了进展。肝纤维化的病机特点为本虚表实，气血淤滞[5]，中药柴胡具有调理肝气的功效，香附具有疏肝理气的功效，三棱具有活血行气的功效，丹参具有活血化瘀的功效，虎杖具有清热解毒的作用，用这五味中药各12 g组成柴虎疏肝煎剂，具有疏肝理气、活血化瘀的功效，可达到治疗肝纤维化的目的。本实验主要观察柴虎疏肝煎剂对肝纤维化大鼠血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(INF-γ)的影响，以期为今后临床中医用药提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组 雌性Wistar大鼠80只，体重160～190 g，6～8周龄，购自新疆医科大学动物实验中心。大鼠分笼饲养于通风、温湿度适宜的动物实验室内。将80只Wistar大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、中药金三莪预防组、柴虎疏肝煎剂预防组、中药金三莪治疗组、柴虎疏肝煎剂低剂量治疗组、柴虎疏肝煎剂中剂量治疗组、柴虎疏肝煎剂高剂量治疗组，共8组，每组10只。

　　1.2 实验仪器与试药 TGL-18B台式离心机(上海安亭厂)，M12/4R洗板机(奥地利)，SUNRISE COUWMBVS酶标仪(奥地利)。三棱、香附、虎杖、柴胡、丹参、郁金、莪术购自新疆医药公司。三棱、香附、虎杖、柴胡、丹参各12g组成疏肝柴虎煎剂。中药金三莪含郁金30 g、三棱12 g和莪术12 g[6]。常规方法制成中药煎剂并且进行浓缩处理，其中柴虎疏肝煎剂浓缩成1ml含柴虎疏肝煎剂1g，中药金三莪浓缩成1 ml中含中药金三莪0.3 g。四氯化碳分析纯(天津市北方天医化学试剂厂)，液体石蜡(天津市福晨化学试剂厂)。大鼠TNF-α和IFN-γ的ELISA检测试剂盒购自北京晶美生物工程有限公司。

　　1.3 方法 正常对照组不作任何处理，其余各组均腹腔注射40%的四氯化碳石蜡油造模剂(首次0.5 ml/100 g体重，之后0.3 ml/100 g体重)，每周两次，4周造模之后改为每周1次，共进行12周，实验中仅饮用10%的酒精。中药金三莪预防组、柴虎疏肝煎剂预防组在造模当日起分别给予中药金三莪0.6 g/100 g体重和柴虎疏肝煎剂1 g/100 g体重灌胃，每天1次，其它所有治疗组不做处理。造模4周之后随机抽取除预防组以外其它各造模组中的任一只处死，证实肝纤维化模型已经建立成功之后，根据参考文献[6,7]灌胃给药。正常对照组和模型对照组给予生理盐水1.0 g/100 g体重，中药金三莪治疗组给予中药金三莪0.6 g/100 g体重，柴虎疏肝煎剂低、中、高剂量治疗组分别给予柴虎疏肝煎剂0.5 g/100 g体重、1.0 g/100 g体重，2.0 g/100 g体重治疗8周。心脏采血留取血标本并在室温静置数小时，4 000 r/min离心，血清-20℃保存备用。按照试剂盒说明书检测各组大鼠血清中TNF-α和IFN-γ的水平。

　　1.4 统计学处理 采用SPLM13.0统计学软件对数据进行统计学处理，数据采用(x±s)表示，组间比较进行多组资料方差分析，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 一般情况 各组大鼠均存活。模型对照组和柴虎疏肝煎剂低剂量治疗组大鼠精神萎靡，活动明显减少，体重增加慢且饮食少，皮毛无光泽而且略发黄，正常对照组大鼠精神好，活动佳，饮食增多，体重增加明显，皮毛有光泽。中药金三莪治疗组及预防组、柴虎疏肝煎剂中、高剂量治疗组及柴虎疏肝煎剂预防组大鼠精神、活动尚可，饮食正常，皮毛有光泽，体重增加明显。

　　2.2 各组大鼠血清TNF-α、IFN-γ水平比较 模型对照组大鼠血清中TNF-α水平明显高于正常对照组(P<0.01)。金三莪预防组、治疗组大鼠血清中TNF-α水平与模型对照组相比明显降低(P<0.05～0.01)。柴虎疏肝煎剂预防组大鼠及柴虎疏肝煎剂低、中、高剂量治疗组大鼠血清中TNF-α水平均低于模型对照组(P<0.05～0.01)，柴虎疏肝煎剂高剂量治疗组大鼠血清中TNF-α水平明显低于柴虎疏肝煎剂低剂量治疗组、预防组(P<0.05)。

　　模型对照组大鼠血清中IFN-γ的水平明显高于正常对照组(P<0.01)。柴虎疏肝煎剂中、高剂量治疗组大鼠血清中IFN-γ的水平较模型对照组相比明显降低(P<0.01)，柴虎疏肝煎剂高剂量治疗组大鼠血清中IFN-γ水平明显低于柴虎疏肝煎剂低剂量治疗组、预防组(P<0.05)(表1)。

　　3 讨论

　　肝纤维化是慢性肝病共同的病理基础，是肝炎向肝硬化甚至肝癌发展的必经之路。鉴于人体实验的局限性，许多实验研究均通过动物实验来完成，建立良好的动物模型是实验成功与否的关键步骤。目前已经建立多种类型的肝纤维化的动物模型，如化学损伤模型、免疫性模型、酒精性模型和营养性模型等[8]。本实验利用40%四氯化碳石蜡油腹腔注射成功的建立了大鼠化学损伤的肝纤维化模型，该模型具有方法简便、易操作、模型稳定、容易重复等优点，是用于慢性炎症引起肝纤维化研究的理想模型。

　　研究表明多种细胞因子参与肝纤维化的形成与发展，多种细胞因子之间通过合成与分泌的相互调节、生物学效应的相互影响组成细胞因子网络来调节肝纤维化的发生、发展和转归。

　　TNF-α在肝纤维化的形成中起到了举足轻重的作用。TNF-α促进转化生长因子(transfer growth factor-β,TGF-β)的释放并且也可以直接刺激储脂细胞和大鼠肝细胞的增殖，合成胶原蛋白和蛋白多糖，同时损伤的肝细胞也可通过多种途径激活邻近的肝星形细胞[9]。孙永年等[10]研究证实细胞因子TNF-α活性水平不仅与肝组织坏死程度相一致，而且成为肝损伤和肝纤维化的启动因子。栾希英等[11]利用三棱、莪术对实验性肝纤维化大鼠进行治疗时发现，治疗组TNF-α的水平明显低于模型组，并且治疗组肝纤维化的程度有所改善，认为此中药通过降低TNF-α的水平起到抗肝纤维化的作用。本实验结果表明中药柴虎疏肝煎剂各治疗组以及预防组均可降低大鼠TNF-α的血清水平，明显低于模型对照组，高剂量治疗组效果优于预防组，提示本中药复方可能通过降低血清中TNF-α水平来起到治疗肝纤维化的作用。

　　IFN-γ具有多种生物学功能，除抗病毒的作用以外，IFN-γ表现出强大的抗增殖、控制细胞凋亡和免疫调节活性的作用。杨小云等[12]研究表明，慢性乙型肝炎组白细胞介素-18和IFN-γ水平显著高于正常对照组，并随肝损害程度、肝纤维化程度的加重而升高，与透明质酸、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原等肝纤维化指标水平成正相关。本次实验得出：中药柴虎疏肝剂中、高剂量治疗组能明显降低血清IFN-γ的水平，与模型对照组相比差异有统计学意义，提示本中药复方可能是通过降低血清中IFN-γ的水平进一步抑制肝脏的炎症反应，减轻肝脏损伤而起到治疗肝纤维化的作用。本实验结果提示柴虎疏肝煎剂可有效降低血清中TNF-α和IFN-γ水平，是否能通过降低血清中这两类细胞因子的水平来起到治疗肝纤维化的作用有待进一步研究。

　　【参考文献】

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