pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒的构建及其活性测定

　　【摘要】 目的：构建pIRES2-绿色荧光蛋白(EGFP)-骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)真核表达质粒，并检测其表达活性。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人骨肉瘤组织中扩增出人骨形态发生蛋白2 (hBMP-2)的基因片段，构建成pIRES2-EGFP-BMP-2重组质粒,经酶切、测序检测其构建的正确性，通过转染3T3细胞后分别采用RT-PCR、免疫组化及Western免疫印迹(Western blotting, WB)法检测其转录、表达活性。结果：构建的pIRES2-EGFP-BMP-2质粒经酶切、测序、RT-PCR、免疫组化、EGFP表达鉴定、WB等检验表明质粒构建成功并具有转录活性。结论：本实验成功构建了具有表达活性的hBMP-2真核表达质粒，为进一步研究用BMP-2基因转染的方法来促进实验动物骨折的愈合奠定了基础。

　　【关键词】 人类; pIRES2-EGFP; 骨形成蛋白2; 基因

　　Construction of the pIRES2-EGFP-BMP-2 plasmid and study on its transcriptional activity

　　ZHAN Yu-lin, BAI Jing-ping, Kurexi·Yunusi, et al

　　(Department of Orthopaedic, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective: The purpose of this study was to construct the pIRES2-EGFP-BMP-2 plasmid of human and explore the feasibility of introducing bone morphogenetic protein 2(BMP-2)gene into 3T3 cell and the function of introduced gene in 3T3 cell.Methods: pIRES2-EGFP-BMP-2 plasmids were constructed, identified and then introduced into 3T3 cell.RT-PCR，IH and WB were done to detect the integration of BMP-2 gene in 3T3 cell.Results: The successful construction of pIRES2-EGFP-BMP2 plasmids were confirmed by the identification of endonuclease cutting，PCR，EGFP protein，IH and WB.RT-PCR demonstrated the specific bands of BMP-2 cDNA in 3T3 cell.WB and IH confirm the expression of BMP-2 protein in cell.Conclusion: The exogenous human BMP-2 gene could be introduced into 3T3 cell.The introduced BMP-2 gene was able to replicate itself and express its protein in 3T3 cell.Our results provided a new pIRES2-EGFP-BMP-2 plasmid and gave us an opportunity to study more.

　　Key words: human; pIRES2-EGFP plasmid; bone morphogenetic protein 2(BMP-2); gene

　　骨形成蛋白2(Bone morphogenic proteins 2, BMP-2)被认为是骨形成蛋白(BMPs)家族中诱导成骨作用最强且能单独诱导成骨的细胞因子。pIRES2绿色荧光蛋白(EGFP)是来源于心肌炎病毒的载体，经改建后，在其中加入了可表达增强绿色荧光蛋白的基因，是一种高效、简便的真核表达载体。本实验构建人骨形成蛋白2(hBMP-2)的基因真核表达载体pIRES2-EGFP-BMP-2，并转染3T3细胞，检测其表达情况,为下一步用基因转染技术促进实验动物的骨折愈合奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 人骨肉瘤组织(新疆医科大学第一附属医院骨科提供),pIRES2-EGFP由新疆医科大学分子生物学实验室保存，IntektTM Total RNA isolation Reagent总RNA提取试剂(UPENERGY公司)，LipofectamineTM2000转染试剂盒(Invitrogen公司),逆转录试剂盒、胶回收试剂盒(Fermentas公司),琼脂糖(Sigma公司),DNA marker(Takara公司),逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)引物(杭州基因研究所合成),质粒快速抽提试剂盒(Omega公司),TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、BglⅡ和EcoRⅠ限制性内切酶、感受态JM109大肠杆菌菌种(Takara公司)，DMEM培养基及G418(Promega公司),免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程公司)，3T3细胞(中国科学院上海生科院细胞资源中心)。

　　1.2 pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达载体的构建

　　1.2.1 引物设计 根据GeneBank中hBMP-2的mRNA核酸序列(NM001200)设计引物:上游引物(P1)5′：ACTCAGATCTGCCACCATGGTGGCCGGGACCCGCTGTC(含BglⅡ位点), 下游引物(P2)5′：CTTCGAATTCCTAGCGACACCCACAACCCTCC(含EcoRⅠ位点)。

　　1.2.2 RT-PCR合成BMP-2cDNA 收集手术切除的新鲜人骨肉瘤组织，切除肿瘤周围正常组织，将瘤体组织置液氮中并转-80℃超低温冰箱保存。实验时从标本中取出约100 mg组织，加入1 ml IntektTM Total RNA isolation Reagent液研磨成组织匀浆后提取总RNA。经过纯化处理的总RNA即可用于逆转录合成cDNA。按逆转录试剂盒说明先合成cDNA第1链，然后以其为模板进行PCR反应。反应体系：10×PCR Buffer 5 μl，dNTP 5 μl，上、下游引物各2 μl，Taq酶1 μl，Mg2+3 μl，cDNA第1链5 μl, ddH2O 27 μl，总体积50 μl;同时用另一管不加cDNA第1链而其余条件相同，作为阴性对照。PCR扩增条件如下：94℃变性5 min，94℃ 30 s、55℃ 45 s、72℃ 35 s循环40次后，72℃最后延伸5 min。取扩增终产物与DL2000marker一起用1.2%琼脂糖凝胶作电泳。切下目的条带，按胶回收试剂盒说明从琼脂糖凝胶中回收PCR扩增产物BMP-2cDNA片段。

　　1.3 pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达载体的构建与鉴定 将获得的目的基因BMP-2cDNA片段和pIRES2-EGFP质粒分别用EcoRⅠ、BglⅡ作双酶切，经酚-氯仿抽提后，用T4DNA连接酶于16℃连接12 h，将二者连接后转化感受态大肠杆菌JM109。转化菌接种于含卡那霉素的LB平板上37℃孵育过夜，挑选白色阳性克隆菌落，经扩增后，用质粒提取试剂提取重组质粒pIRES2-EGFP-BMP-2。将提取的质粒用EcoRⅠ、BglⅡ作双酶切，取产物与DL15 kbp marker作琼脂糖凝胶电泳、鉴定。将所提取重组质粒pIRES2-EGFP-BMP-2纯化处理后送上海生工生物工程技术服务有限公司作测序鉴定。

　　1.4 脂质体介导的pIRES2-EGFP-BMP-2转染和阳性克隆筛选、培养 3T3细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液培养，以3×105个细胞/孔接种6孔板，待生长占每孔面积的80%时开始转染。用无血清DMEM溶液洗细胞2次，取脂质体LipofectamineTM2000 20 μl(1 mg/μl)，加入500 μl无血清DMEM培养液中，另取5 μg重组质粒加入500 μl无血清DMEM培养液中，两液体混匀，室温放置30 min，轻轻覆盖细胞表面，置CO2培养箱(37℃，50 ml/L CO2)，6 h后更换含10%小牛血清的DMEM培养液。培养2 d后换用含400 mg/L的G418 DMEM培养液，72 h后取部分细胞观察EGFP的表达。其余部分继续用含400 mg/L G418 DMEM培养液进行筛选，2周后当细胞大部分死亡时，换含200 mg/L G418的培养液维持筛选，4周后检测BMP-2在3T3细胞内的表达情况。

　　1.5 BMP-2在3T3细胞内的表达

　　1.5.1 EGFP表达的检测 将细胞爬片用PBS洗涤2次, 40 g/L多聚甲醛固定20 min，用PBS洗涤2次，再以蒸馏水洗3～4次，滴加500 ml/L甘油缓冲液封片，于荧光显微镜下观察阳性细胞。

　　1.5.2 RT-PCR检测 收集转染后经G418筛选的部分3T3细胞,提取总RNA，按本实验所设计的引物及实验条件和方法进行RT-PCR反应及琼脂糖凝胶作电泳鉴定,以同期未转染的3T3细胞作对照。

　　1.5.3 Western blotting检测 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离细胞蛋白，电转移至硝酸纤维膜上，使用人多克隆抗体进行检测。

　　1.5.4 免疫组化检测 收集转染后经G418筛选部分细胞,细胞爬片用冷丙酮固定20 min，0.5%H2O2/甲醇处理30 min，依次滴加山羊血清封闭液、一抗、二抗、SABC试剂,各步骤间均用PBS多次漂洗，DAB显色，酒精逐级脱水，二甲苯透明,中性树胶封片。以同期未转染的3T3细胞作对照。

　　2 结果

　　2.1 pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达载体的鉴定结果

　　2.1.1 酶切电泳鉴定结果 重组质粒pIRES2-EGFP-BMP-2经EcoRⅠ、BglⅡ双酶切电泳后,前者出现了1.2 kbp和5.3 kbp两条带(1.2 kbp为hBMP-2cDNA片段,5.3 kbp为pIRES2-EGFP线状质粒), 重组质粒pIRES2-EGFP-BMP-2出现6.5 kbp条带(为重组质粒pIRES2-EGFP-BMP-2),初步表明重组质粒构建成功(图1)。

　　图1 pIRES2-EGFP-BMP-2酶切电泳鉴定结果(略)

　　1: pIRES2-EGFP-BMP-2经EcoRⅠ/BglⅡ双酶切电泳后,出现了1.2 kbp和5.3 kbp两条带; 2: DL15000 DNA marker

　　2.1.2 测序鉴定结果 测序结果经BLAST软件分析,其核酸序列与Gene Bank中hBMP-2的mRNA序列(NM2001200)的编码序列同源性完全相符,进一步证实本实验所克隆的基因为人BMP-2cDNA。

　　2.2 BMP-2在3T3细胞内表达的检测结果

　　2.2.1 EGFP的表达检测 72 h后观察转染的3T3细胞，可见EGFP的持续表达，EGFP分布于整个细胞，呈胞浆分布，说明重组载体构建成功并能在体细胞中表达(图2)。

　　图2 转染72 h后的3T3细胞可见EGFP(略)

　　2.2.2 RT-PCR检测 转染pIRES2-EGFP-BMP-2的3T3细胞经G418抗性筛选并传代、培养4周后，RT-PCR反应可扩增出112 kbp条带，大小与预期相符合,而未转染pIRES2-EGFP-BMP-2的细胞则未扩增出条带。证明pIRES2-EGFP-BMP-2成功导入细胞,并有hBMP-2mRNA的表达(图3)。

　　2.2.3 Western blotting检测结果 SDS-PAGE分离细胞蛋白，电转移至硝酸纤维膜上，经人多克隆抗体检测，pIRES2-EGFP转染的NIH3T3细胞及未转染的NIH3T3细胞未见反应显色带，而经pIRES2-EGFP-BMP-2转染的NIH3T3细胞在相对分子质量(Mr)为14×103处显现单一特异性条带，表明为BMP-2基因表达产物(图4)。

　　图3 转染pIRES2-EGFP-BMP-2的3T3细胞的RT-PCR检测(略)

　　1: 未转染pIRES2-EGFP-BMP-2的3T3细胞; 2: 转染pIRES2-EGFP-BMP-2的3T3细胞

　　图4 3T3细胞Western blotting检测结果(略)

　　1: 转染后的3T3细胞; 2: 未转染的3T3细胞

　　2.2.4 免疫组化检测结果 转染pIRES2-EGFP-BMP-2后经G418抗性筛选并传代、培养4周后的3T3细胞细胞质中有棕黄色颗粒阳性信号,而未转染pIRES2-EGFP-BMP-2的细胞则为阴性,证明转染pIRES2-EGFP-BMP-2后的3T3细胞中有BMP-2蛋白的表达。

　　3 讨论

　　目前基因治疗已成为世界上最活跃的研究领域,在遗传病与肿瘤治疗方面的作用已得到确认[1]。hBMP-2在骨修复过程中能促进细胞增殖、分化和基质分泌,在体内、体外均可诱导成骨,同时BMP-2是骨基质中存在的最重要骨生长因子,其主要生物学作用是促进未分化的间充质细胞和骨系细胞的募集和分化,是骨生成的启动因子,因而可以作为骨修复基因治疗的理想目的基因[2]。一个成功的基因治疗包括目的基因获得,将目的基因转入靶细胞,获得目的基因的高水平表达并持续一段时间，从而达到加速骨折愈合的目的。基因向细胞内转移存在两个问题:一是基因载体的选择,二是应当在体内或在体外将基因向细胞内转移,并避开溶酶体的降解作用进入细胞核内。裸DNA具有价廉、安全的优点,但是,没有载体帮助,细胞摄入目的基因的效率较低,载体可以显著提高细胞对目的基因的摄入和表达水平。

　　目前,转基因所用载体可以是病毒类或非病毒类。非病毒类(如脂质体)价格比病毒低廉且安全,较少产生抗原性[3]。病毒作为真核表达载体越来越受到青睐，目前常用于载体的病毒有逆转录病毒和腺病毒。逆转录病毒作为载体的主要优点是：(1) 病毒对体外细胞转染能力较强，培养细胞的病毒转染率有时可高达80%;(2) 病毒整合到宿主细胞染色质后可稳定进行表达[4]。该病毒的主要缺点为：(1) 只能转染和整合到分裂状态的细胞内;(2)可能造成插入突变或引起抑癌基因失活或致癌基因激活;(3) 整体转染效率较低。而非病毒载体则可以克服以上潜在的缺陷性, 脂质体介导基因转染法是目前最常用的方法之一，技术成熟，安全可靠。人工阳离子脂质体由表面带正电荷双层脂质分子组成，它可以与带负电荷的DNA、RNA或反义寡聚核苷酸等带阴离子物质自发而快速结合成复合体，通过细胞膜融合或受体介导的胞饮作用将外源性核苷酸转移入细胞内,在胞浆中将释放的质粒DNA分子转移入细胞核内，一般以非整合方式存在。该方法的优点为：(1) 简便，可以携带较大DNA分子;(2) 较安全，可转染细胞类型较多，而且靶细胞不必处于分裂状态。该方法的缺点为：转染效率较低，缺乏细胞选择性，静脉注射时容易被网状内皮系统吞噬，不能有效达到靶组织;进入细胞后，容易被溶酶体中核酸酶降解;脂质体本身也不稳定。其中以阳离子脂质体介导的载体系统(质粒) 的应用最为广泛,其无免疫原性、无毒、无致癌性,易大量制备,转染效率虽不及病毒载体高,但已通过美国国立卫生研究院(NIH)和重组DNA咨询委员会(RAC)的批准作为基因治疗的载体进入Ⅱ期临床实验,用于某些癌症的治疗。因此,从后期动物实验安全等方面的综合考虑,本实验选择阳离子脂质体介导的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP-BMP-2转染3T3细胞,使其在细胞内产生高效、稳定的暂时表达,并诱导分化大量的成骨细胞和软骨细胞,促进新骨形成。这既符合骨缺损修复基因治疗的要求,同时避免病毒载体介导的基因治疗有可能存在的潜在缺陷性。

　　本实验拟将外源目的基因片段(hBMP-2)同载体分子(pIRES2-EGFP)重组构成pIRES2-EGFP-BMP-2表达载体,并利用此载体先导入大肠杆菌中实现目的基因hBMP-2的克隆(扩增)。经过筛选后,将含有hBMP-2基因的表达载体通过脂质体介导转染3T3细胞,在体外将获得rhBMP-2稳定表达的细胞克隆,筛选并传代、培养扩增,实现外源基因rhBMP-2持续高效的表达，并调节细胞的增殖、分化及功能, 为进一步用基因治疗骨形成的实验奠定基础。本实验在脂质体介导下将pIRES2-EGFP-BMP-2基因转染3T3细胞, 通过RT-PCR和免疫组化检测证实转染后经G418筛选培养至4周后,在基因和蛋白水平上均有hBMP-2稳定表达,证实了表达载体pIRES2-EGFP-BMP-2的有效性,从而为进一步用基因治疗技术加速骨形成的实验打下良好基础。

　　【参考文献】

　　[1] Steinert AF, Palmer GD, Evans CH.Gene therapy in the musculoskeletal system[J].Curr Opin Orthop,2004,15:318-324.

　　[2] 郭书权,许建中.BMP-2诱导成骨及传送的研究进展[J].第三军医大学学报,2005,27(16):1707-1710.

　　[3] Zhang Y, Sekirov L, Saravolac E, et al.Stabilized plasmid-lipid particles for regional gene therapy: formulation and transfection properties[J].Gene Ther,1999,6:1438-1447.

　　[4] Evans CH, Ghivizzani SC, Robbins PD, et al. The 2003 nicolas andry award orthopaedic gene therapy[J].Clin Orthopaed & Rel Res, 2004, 429:316-329.