CYP4A11基因单核苷酸多态性与高血压的相关性研究

　　【摘要】 目的： 研究CYP4A11基因单核苷酸多态性与高血压的相关性。方法：收集304例日本高血压患者(高血压组)和207例年龄匹配、血压正常的日本人(对照组)，选择CYP4A11基因的3个单核苷酸多态性 (SNPs，rs2269231, rs9333025, rs1126742)，应用TaqMan SNP基因分型的方法进行基因分型，分析并比较不同性别高血压组和对照组3个SNPs基因型频率和等位基因频率的分布，并应用Logistic回归分析方法分析高血压主要危险因素对结果的影响,分析CYP4A11基因与高血压的相关性。结果：全体,高血压组和对照组rs1126742的基因型分布差异有统计学意义(P=0.005);对于全体、男性、女性，高血压组和对照组的rs1126742的隐性模型分布(CC versus CT+TT)存在差异(P分别为0.007、0.043、0.045);Logistic回归分析显示,对于全体和男性，rs1126742的CT+TT基因型更常见于高血压患者(P分别为0.015、0.048)。结论：CYP4A11基因的rs1126742可作为日本男性高血压标志,其CT+TT基因型与日本男性高血压有关。

　　【关键词】 CYP4A11; 单核苷酸多态性; 病例对照

　　基金项目：新疆维吾尔自治区高校科研计划创新研究群体基金(XJEDU2005G03);新疆教委内科重点学科基金(200501)

　　Association between the SNPs of human CYP4A11 gene and essential hypertension

　　FU Zhen-yan, MA Yi-tong, YANG Yi-ning, et al

　　(Department of Cardiology, Frist Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective: The aim of the present study was to assess the association between the human CYP4A11 gene and essential hypertension (EH), using a case control study that included a separate analysis of the gender groups.Methods: There were 304 EH patients and 207 age-matched controls genotyped for 3 SNPs of the human CYP4A11 gene (rs2269231, rs1126742, rs9333025).The data were assessed for 3 separate groups: the total subjects, men and women.Results: For the total, the genotypic distribution of rs1126742 differed significantly between the two groups (P=0.005).For the total, and the men and women groups, the recessive model (CC versus TC+TT) of rs1126742 differed significantly between the two groups (P=0.007, 0.043, 0.045, respectively).Logistic regression analysis showed that the TC+TT genotype was significantly higher in EH patients than in controls for the total subjects and the men (P=0.022, 0.043, respectively). Conclusions: The present results indicate that rs1126742 of CYP4A11 gene can be a marker of EH in Japanese men.The TC+TT genotype of rs1126742 is associated with EH in Japanese men.

　　Key words: CYP4A11; single nucleotide polymorphism (SNP); case control study

　　高血压是脑卒中、心肌梗死、充血性心力衰竭和高血压肾病发病、死亡的主要危险因素[1]。高血压的病因和发病机制非常复杂，目前认为是遗传易感基因和环境多种因素相互作用，研究已经证实多种基因的多态性与高血压相关[2]。特定基因敲除小鼠表现高血压表型是非常有效的寻找高血压易感基因的方法[3]。

　　CYP4A11是细胞色素p450家族成员之一，它的主要功能是催化花生四烯酸生成20-羟二十烷四烯酸(20-HETE)，20-HETE具有调节血压的作用。近来有报道，CYP4A14和CYP4A10(人类CYP4A11的同形体)基因敲除小鼠可引起高血压,而且雄性小鼠比雌性小鼠血压增加更高[4, 5]。小鼠CYP4A14和CYP4A10并不存在于人类，人类与之相应的异体同型体是CYP4A11，分别有72.69 %和73.02 %的氨基酸序列与CYP4A14和CYP4A10小鼠相同，因此 CYP4A11在人体中可能扮演着和CYP4A14、CYP4A10 同样的角色[6]。人类CYP4A11基因位于1号染色体p33，长约12.57 kbp，有12个外显子，本研究应用病例对照的方法研究不同性别高血压患者CYP4A11基因和高血压的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象 选择304例日本原发性高血压患者，其中男性211例，女性93例, 平均(59.1±10.0)岁。选择标准：安静坐位时收缩压>160 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)和/或舒张压>100 mmHg，在第1次检查后的2个月内的3次偶测血压均符合上述标准;已经确诊为原发性高血压，正在服用降压药物的高血压患者。选择207例无高血压家族史、血压正常的日本人作为对照组，其中男性136例，女性71例,平均(60.9±11.9)岁。

　　1.2 主要仪器与试剂 ABI7000型实时定量荧光PCR仪(ABI公司)，UNICO WFZ UV-2102型紫外可见分光光度计(尤尼柯公司)。TaqMan Universal PCR master Mix试剂盒(含dNTP、PCR缓冲液和AmpliTaq Gold DNA聚合酶)、SNP Genotyping Product试剂盒(含引物和探针)均购自ABI公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 DNA提取 按常规酚-氯仿抽提法提取高血压组及对照组外周血白细胞的DNA, 稀释DNA样本并用紫外可见分光光度计检测DNA浓度, 保证各DNA样本浓度基本一致。

　　1.3.2 SNP位点的选择及检测 人类CYP4A11基因目前在NCBI数据库登记有121个单核苷酸多态性(SNPs)。本研究筛选CYP4A11基因的标签SNPs，首先选择了rs9333025和rs2269231，二者的最小基因频率(MAF)>30%，表明二者是有效的基因标记;另外选择了rs1126742，这个位点的非同义替换会导致CYP4A11基因功能的变化且证实与高血压相关。按照从5′-3′的基因方向，命名这3个SNP为: SNP1(rs2269231)、SNP2(rs1126742)、SNP3(rs9333025)，SNP1 和 SNP3 位于内含子，SNP3位于外显子。TaqMan法检测SNP，在ABI7000型实时定量荧光PCR仪上先进行96孔板的绝对定量PCR扩增, 反应液为: 引物/探针混合液1.25 μl(其中每条引物18 μmol/L, 每条探针4 μmol/L终浓度), PCR反应混合液: 12.5 μl, 基因组DNA: 1～3 ng, 加H2O至25 μl。反应条件为: 95℃ 10 min预变性, 95℃ 15 s, 60℃ 1 min(40个循环)。

　　PCR反应结束后, 继续在同一96孔板上做等位基因分布检测, 反应条件为: 60℃ 10 min, 保存记录结果。分析并比较不同性别间高血压组和对照组3个SNPs基因型频率和等位基因频率的分布，并应用Logistic回归分析方法分析高血压主要危险因素对结果的影响。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，并应用Mann-Whitney U 检验;计数资料应用Fisher检验;卡方检验检测等位基因频率是否符合Hardy- Weinberg平衡定律;基因型频率和等位基因频率分析应用Fisher检验，检验水准α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 3个SNP基因型和等位基因的分布 3个SNP的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡。对于全体，高血压组和对照组rs1126742的基因型分布差异有统计学意义(P=0.005)。对于全体、男性、女性，高血压组和对照组的rs1126742的隐性模型(CC versus TC+ TT)分布差异有统计学意义(P值分别为0.007、0.043、0.045)。显性和隐性模型由全体对照组的基因型频率决定(表1)。

　　2.2 Logistic 回归分析结果 对于全体和男性，高血压组和对照组的TC+TT基因型分布仍然保持明显差别(P=0.022、0.043)(表2)。

　　表1 2组3个SNP基因型频率、等位基因频率分布(略)

　　表2 Logestic 回归分析高血压主要危险因素和SNP基因型的关联比值比 (OR)和 95%可信区间 (CI)(略)

　　3 讨论

　　CYP4A11不仅在肝脏参与脂肪酸的代谢而且在肾脏参与血压的调节[7, 8]。CYP4A11将花生四烯酸转化为20-HETE，20-HETE具有升压、降压双重作用。在肾小管，20-HETE能阻止钠离子转运，有利尿降压作用;在肾血管，20-HETE收缩血管，具有升压作用[9, 10]。动物和人类研究均表明CYP4A11是高血压候选基因之一[9, 11]。Gainer等[12]首先发现CYP4A11的T8590C 单苷酸多态性(在NCNI网上数据库登记为rs1126742)，他们在动物体内实验检测CYP4A11和20-HETE代谢动力特点，发现该位置的胸腺嘧啶脱氧核苷酸(T)突变为胞嘧啶脱氧核苷酸(C)会导致苯丙氨酸突变为丝氨酸，从而影响20-HETE的合成，并在大样本人群研究中证实rs1126742与高血压相关。Mayer等[13]也证实rs1126742与高血压相关，但并未发现rs1126742与高血压引起的心脏大小、结构、左室功能改变有关。本研究对日本人CYP4A11基因的3个SNP进行了分型，并应用病例对照研究的方法评价CYP4A11与高血压的关系。

　　高血压的发病情况存在性别差异，并且CYP4A14-/- 和CYP4A10-/- 基因敲除小鼠都表现雄性比雌性血压水平更高，因此本研究分为3个研究群体：全体、女性、男性，结果发现高血压组和对照组的rs1126742隐性模型(CC vs TC+TT)基因型分布分别在全体、女性、男性中有明显差异，表明rs1126742的T等位基因会增加高血压的风险。本研究结果经Logistic回归分析后，显示rs1126742 的TC+TT基因型分布在全体和男性的高血压组、对照组之间仍有明显差异，而女性这种差异则消失，结合CYP4A14-/-基因敲除小鼠和CYP4A10-/-基因敲除小鼠表现雄性小鼠血压明显高于雌性小鼠，且cyp4a14-/-基因敲除小鼠的血压与雄性激素相关，推测rs1126742与高血压的关系存在性别差异。研究结果的不一致可能与种族差异、研究设计不同有关。

　　本研究结果表明，rs1126742是日本男性高血压的基因标志，其TC+TT基因型与日本男性高血压有关。CYP4A11基因突变对血压的影响以及CYP4A11功能变化与性激素代谢是否有关还需进一步研究证实。

　　【参考文献】

　　[1] Barri YM.Hypertension and kidney disease: a deadly connection[J].Curr Cardiol Rep, 2006, 8:411-417.

　　[2] Ruppert V, Maisch B.Genetics of human hypertension[J].Herz, 2003, 28:655-662.

　　[3] Bader M.Mouse knockout models of hypertension[J].Methods Mol Med, 2005, 108:17-32.

　　[4] Holla VR, Adas F, Imig JD, et al.Alterations in the regulation of androgen-sensitive Cyp 4a monooxygenases cause hypertension[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98:5211-5216.

　　[5] Nakagawa K, Holla VR, Wei Y, et al.Salt-sensitive hypertension is associated with dysfunctional Cyp4a10 gene and kidney epithelial sodium channel[J].J Clin Invest, 2006, 116:1696-1702.

　　[6] Imaoka S, Ogawa H, Kimura S, et al.Complete cDNA sequence and cDNA-directed expression of CYP4A11, a fatty acid omegahydroxylase expressed in human kidney[J].DNA Cell Biol, 1993, 12: 893-899.

　　[7] Lasker JM,Chen WB,Wolf I,et al.Formation of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid, a vasoactive and natriuretic eicosanoid, in human kidney.Role of Cyp4F2 and Cyp4A11[J].J Biol Chem, 2000, 275:4118-4126.

　　[8] Powell PK, Wolf I, Lasker JM.Identification of CYP4A11 as the major lauric acid omega-hydroxylase in human liver microsomes[J].Arch Biochem Biophys, 1996, 335:219-226.

　　[9] McGiff JC, Quilley J.20-Hydroxyeicosatetraenoic acid and epoxyeicosatrienoic acids and blood pressure[J].Curr Opin Nephrol Hypertens, 2001, 10:231-237.

　　[10] Roman RJ.P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function[J].Physiol Rev, 2002, 82:131-185.

　　[11] Laffer CL, Laniado-Schwartzman M, Wang MH, et al.Differential regulation of natriuresis by 20-hydroxyeicosatetraenoic acid in human salt-sensitive versus salt-resistant hypertension[J].Circulation, 2003, 107:574-578.

　　[12] Gainer JV, Bellamine A, Dawson EP, et al.Functional variant of CYP4A11 20-hydroxyeicosatetraenoic acid synthase is associated with essential hypertension[J].Circulation, 2005, 111:63-69.

　　[13] Mayer B, Lieb W, Gtz A, et al.Association of the T8590C polymorphism of CYP4A11 with hypertension in the MONICA Augsburg echocardiographic substudy[J].Hypertension, 2005, 46:766-771.