锌、硒对砷诱导金属硫蛋白合成影响的研究

　　【摘要】 目的：探讨锌、硒对砷诱导金属硫蛋白合成的影响。方法：采用亚慢性毒性实验方法,分别测定小鼠肝脏中金属硫蛋白(MT)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活力。结果: 砷低剂量组、单纯锌组和单纯硒组肝脏MT含量升高，高于对照组和砷高剂量组(P<0.05)。随着砷染毒剂量的增加,小鼠肝脏组织中MDA含量增加,SOD、GSH-Px活性降低,且呈剂量-效应关系。结论: 亚砷酸钠能够诱导小鼠产生金属硫蛋白，金属硫蛋白含量与抗氧化能力存在相关性，锌、硒能抑制MDA生成量,提高SOD、GSH-Px活性，增加抗氧化能力，从而拮抗砷毒性。

　　【关键词】 金属硫蛋白 砷 锌 硒 抗氧化

　　Study of zinc, selenium on arsenic induced metallothionein synthesis in mice

　　WANG Ting, ZHENG Yu-jian, WU Shun-hua, et al

　　(Department of Occupational and Environmental Hygiene, College of Public Health, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011,China)

　　Abstract： Objective： To explore zinc, selenium on arsenic induced metallothionein synthesis in mice. Methods： Subchronic toxicity experiment was applied. Then the mice organic contents of metallothionein (MT) and lipid peroxides degradation product malondialdehyde (MDA), the total superoxide dismutase (SOD) activities and glutathione peroxidase (GSH-Px) activities in liver were determined individually. Results： Compared with the control group and high arsenic group, the MT contents of liver were higher in low arsenic, Zn and Se groups, while liver MT contents had statistically results (P<0.05). The results showed that with the increases of exposure levels of arsenic, the contents of MDA increased and the activities of SOD and GSH-Px decreased and showed a dose-effect manner. Conclusion： Arsenic can induce metallothionein protein. MT has correlation to anti-lipid peroxidation. Zinc and selenium could decrease the contents of MDA and increase the activities of SOD and GSH-Px significantly, which can increase anti-lipid peroxidation ability and against arsenic toxicity.

　　Key words： metallothionein; arsenic; zinc; selenium; anti-lipid peroxidation

　　地方性砷中毒是自然环境中含砷量过高引起的生物地球化学性疾病，在世界范围广泛流行，已成为一种严重威胁人类健康的公害病[1]。无机砷是国际癌症研究中心(IARC)确认的人类致癌物，可致皮肤癌、肺癌，并伴有其它内脏癌高发[2]。金属硫蛋白(MT)是一种富含巯基的蛋白质，其抗氧化功能日益引起人们的重视。本研究以染砷小鼠为模型，分别加入锌和硒制剂，比较不同剂量砷对小鼠金属硫蛋白的诱导及锌、硒对砷中毒的干预效应，为砷中毒的研究及防治提供科学依据。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物及分组健康昆明种小鼠120只,雄性,体重18～22 g，由新疆医科大学实验动物中心提供。适应性喂养1周后,随机分成8组：正常对照组、砷低剂量组、砷中剂量组、砷高剂量组、高砷+锌组、高砷+硒组、单纯锌组及单纯硒组，每组15只。受试小鼠自由饮水进食。

　　1.2方法根据预实验中小鼠经口半数致死量(LD50)的实验结果确定干预浓度。分别以NaAsO2对小鼠经口半数致死量(LD50)的1/2、1/10 、1/50倍作为砷干预组的高、中、低剂量;以Na2SeO3对小鼠经口半数致死量(LD50)的1/10倍作为硒干预组，以5 mg/kg 硫酸锌作为锌干预组[3]。染毒方式：小鼠经口灌胃染毒，灌胃量为0.2 ml/10 g体重，每天给药1次，连续8周，每周一空腹称重，根据体重调整灌胃量。

　　1.3观察指标各组小鼠肝脏组织金属硫蛋白含量， 采用银饱和分析法测定[4];肝脏组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，采用试剂盒测定(南京建成生物工程研究所提供)，具体测定方法参见试剂盒说明书。

　　1.4统计学处理应用SPSS11.0软件包进行统计学分析,采用方差分析及q检验,检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1各组小鼠肝脏组织中金属硫蛋白的测定除砷高剂量组，其余各组肝脏MT含量均高于正常对照组，其中砷低剂量组、单纯锌组和单纯硒组肝脏MT含量与正常对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05~0.01)。砷低剂量组、单纯锌组和单纯硒组肝脏MT含量与砷高剂量组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)(表1)。

　　表1各组小鼠肝脏组织MT含量(略)

　　注：与砷高剂量组比较， **P<0.01， 与正常对照组比较， △P<0.05， △△P<0.01

　　2.2各组小鼠肝脏MDA含量和SOD、GSH-Px 活性的比较与正常对照组相比，砷低剂量组、砷中剂量组、砷高剂量组MDA含量升高，GSH-Px和SOD活性降低(P<0.01);单纯锌和单纯硒组MDA含量降低((P<0.01)，GSH-Px和SOD活性升高(P<0.01)。与砷高剂量组比较，高砷+锌组和高砷+硒组MDA含量降低，GSH-Px和SOD活性升高，其差异具有统计学意义(P<0.01)(表2)。

　　表2各组小鼠肝脏MDA含量和SOD、GSH-Px 活性的比较(略)

　　注：与砷高剂量组比较， **P<0.01; 与正常对照组比较， △P<0.05， △△P<0.01

　　2.3肝脏MT含量和抗氧化能力相关分析肝脏MT含量和SOD、GSH-Px之间存在正相关性(=0.331, P=0.000; r=0.285, P=0.002)，和MDA间存在负相关性(r=-0.366, P=0.000)。

　　3讨论

　　Jiang等[5]研究报道了砷与金属硫蛋白相互作用而且确定了金属硫蛋白与新近发现的三价砷代谢物质间的化学键结合。正常情况下，生物体内的自由基处在平衡状态，自由基的产生和清除保持一定的浓度。MT含有大量-SH键和低能空轨道，能有效清除多种自由基， MT中的亲电巯基基团可以通过氢供体使受损的DNA得以修复。尽管MT的物理、化学及遗传特性已经比较清楚，但其确切的生理功能仍有待于进一步的研究。目前，国内外有关砷对MT诱导的报道不多，结果也不尽相同。而且由于实验方法和取材的不同，MT在体内的抗氧化损伤作用尚存争议。许多研究均证明，MT具有优于其他抗氧化剂的保护作用;但亦有报道称MT在体内不能保护小鼠抗氧化损伤作用[6]。本研究表明，砷可诱导小鼠产生金属硫蛋白，低剂量砷能明显诱导肝脏组织产生较多金属硫蛋白，有效提高抗氧化能力，与正常对照组比较差异具有统计学意义。MT与抗氧化能力相关分析也表明肝脏MT含量和SOD、GSH-Px之间存在正相关性，和MDA间存在负相关性。有些学者利用金属硫蛋白易被诱导的特点，曾筛选了含Cd、Ge、As、Bi、Zn、Cu、Se等元素的化合物，并用Hg结合法测定了用药5 d后小鼠心、肝、肾及肿瘤组织中的金属硫蛋白含量。结果发现非金属元素硒也能诱导金属硫蛋白的合成，其诱导能力不仅大大超过Bi和Zn， 甚至要比目前公认为的金属硫蛋白诱导能力最强的Cd的作用还好，且不影响肿瘤中金属硫蛋白水平。随后又用ELISA法再次证实了硒确实对金属硫蛋白有诱导作用，且诱导效果高于Zn约8～9倍,由此确立了硒诱导金属硫蛋白的存在及利用这一生物学途径性研究的可能性[7]。在本次实验中，亚硒酸钠可诱导小鼠产生金属硫蛋白，这与徐卓立等[8]的报道一致，且加硒组小鼠的抗氧化水平与正常对照组比较有显著提高，可能由于硒在机体内主要以硒代半胱氨酸的形式存在，也可以替代半胱氨酸中的硫，而金属硫蛋白最显著的特点就是含有大量的半胱氨酸残基，另一方面体内重要的抗氧化酶-谷胱甘肽过氧化物酶中含有硒，通过体外补硒可以增加其活力。锌是肝MT合成的最重要的金属元素之一，其在MT诱导合成中起重要作用。MT结合的二价金属，特别是锌本身在一定程度上也可通过干扰细胞膜上的不饱和脂质的过氧化而起到抗氧化作用，同时锌离子浓度的增加可提高锌离子与镉离子的竞争力，不仅可使SOD的破坏减少，还可使之合成增加，从而减少超氧阴离子自由基，减轻镉对肾组织的损伤[9]。本实验研究发现给予小鼠适量锌后，可以诱导MT的产生，同时高砷+锌组MT含量也有所提高，MT在锌对砷毒性的拮抗作用中是否也是锌改变砷在肝组织中的亚细胞分布，使更多的砷蓄积在胞质中，而胞核、线粒体、微粒体中砷的含量则相应下降，其具体机制将有待于进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]郑玉建，肖静，吴顺华.DNA修复基因XPD多态性与地方性砷中毒关系的研究[J].新疆医科大学学报，2006，29(1)：5-7.

　　[2]Higginson J, DeVita VT. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risk of chemicals to humans[J]. Am Ind Hyg Assoc J,1980 ,41(5)：26-30.

　　[3]李守明，刘志勇.金属硫蛋白与疾病的关系[J].江西医药，2004，39(6)：434-437.

　　[4]张宝林,盛湘蓉,刘兴军，等.金属硫蛋白测定方法—银饱和分析法[J].药物生物技术,1996,3(1):31-33.

　　[5]Jiang G,Gong Z,Li XF, et al. Interaction of trivalent arsenicals with metallothionein[J]. Chem Res Toxicol, 2003,16(7):873-880.

　　[6]赵红光,龚守良.金属硫蛋白抗氧化损伤作用及其机制[J].吉林大学学报(医学版),2005，31(2):322-324.

　　[7]雍政,何冰,郭军华.硒与金属硫蛋白的研究进展[J].解放军药学学报,2003, 19(4):285-287.

　　[8]徐卓立,郭军华,刘颖.硒对金属硫蛋白的诱导作用及硒代金属硫蛋白的生成[J].解放军药学学报,2004,20(1):11-14.

　　[9]杨巧媛.金属硫蛋白在锌拮抗镉毒性中的作用[J].国外医学卫生学分册,2000, 27(3):156-160.