4种新疆植物提取物对人肝癌细胞生长抑制作用的研究

　　【摘要】 目的： 研究新疆地产植物野蔷薇、黑加仑 、沙枣、巴旦杏提取物对人肝癌细胞的抑制作用。方法： 将野蔷薇、黑加仑、沙枣、巴旦杏分别分为高、中、低剂量组(10-1、10-2 、10-3g/ml),另设阳性(顺铂)对照组、阴性对照组(含同一细胞密度的培养液)、溶剂对照组(7.5%甘油)，　在人肝癌细胞中加入不同剂量浓度的受试物，分别于24、48、72 h在倒置显微镜下观察肿瘤细胞的生长情况，通过MTT比色法测定OD值。结果： 与阴性对照组比较，野蔷薇高剂量和黑加仑72 h、沙枣和巴旦杏48 h对肿瘤细胞QCY-7404的抑制作用最强，野蔷薇和黑加仑的抑瘤作用随时间的延长而加强，而沙枣和巴旦杏的抑瘤作用与时间没有依赖关系。结论： 野蔷薇、黑加仑、沙枣和巴旦杏提取物高剂量对肿瘤细胞QCY-7704有明显的抑制作用。

　　【关键词】 野蔷薇 黑加仑 沙枣 巴旦杏 抗肿瘤

　　The study of the inhibitory action of the extractions from four kinds of Xinjiang plants on human liver cancer cell growth

　　SUN Jian-xin, ZHU Hu-hu, XIAO Hui, et al

　　(Medical Laboratory Animal Center, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective: To study the inhibitory effect of human liver cancer cell by extractions from Xinjiang area plants multiflora rose, black current, narrow-leaved oleaster, almond tree. Methods: There were high, middle and low dosage groupe (10-1, 10-2, 10-3g/ml), positive (cis platinum) control group, negative control group (including identical cell density nutrient fluid), solvent control group (7.5% glycerine),adds the different density of the dosage to the human liver cancer cell and keep in 24 h, 48 h and 72 h, separately. Then the situations of the tumor cell growth under the inverted microscope werd observed and the OD values through the MTT colorimeter were recorded. Results: The high dose (10-1 g/L) of the multiflora rose and black current which keep in 72 h, the black current and the amygdalus communis which keep in 48 h were the best to suppress the tumor cell of QCY-7404, compare the ends with the negative control group, at the same time its OD value respectively were: 0.196±0.030, 0.156±0.021, 0.243±0.024, 0.377±0.022 respectively (P<0.01). Conclusion: Multiflora rose, black current, narrow-leaved oleaster, almond tree extraction have obvious effects to inhibit the growth of the tumor cell QCY-7704.

　　Key words： multiflora rose; black current; narrow-leaved oleaster; almond tree; anti-tumor

　　肝癌为我国常见恶性肿瘤之一,其死亡率在消化系统恶性肿瘤中列第3位,仅次于胃癌和食管癌，严重影响人民群众的健康和生命 [1]。从植物中寻找抗肿瘤活性成分是肿瘤研究的重要领域。新疆是中国野生植物的王国，唐代《新修本草》中就记载了114种西域名贵药物[2]，新疆地大物博，特殊的光热资源和强烈的昼夜温差培育出许多具有特殊的抗突变药理作用的生物群落。本实验采用新疆植物野蔷薇、黑加仑、沙枣、巴旦杏提取物对人肝癌细胞生长抑制作用进行研究，旨在为进一步研究开发抗癌药物积累资料。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.14种植物的提取工艺野蔷薇、黑加仑 、沙枣、巴旦杏(新疆喀什地区)分别加入50%乙醇溶液适量,体积比约为1∶2,热水浴(50℃)提取3次,每次2 h;合并3次提取液,过滤,水浴(50℃)浓缩并回收乙醇至浸膏,置冰箱备用。

　　1.1.2细胞株人肝癌细胞株(QCY-7404)由中国科学院上海细胞生物研究所细胞库提供。

　　1.1.3主要器材及试剂CO2培养箱(美国NAPL,Model5410)，超净工作台，倒置显微镜(重庆)，酶标仪(上海)，离心机(上海)，顺铂(CDDP)，RPM1640(Gibco产品)，新生牛血清(FCS,杭州四季青公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，MTT(AMRESCO公司)，DMSO(AMRESCO公司)。

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养野蔷薇、黑加仑 、沙枣、巴旦杏均分别分为高、中、低剂量组(10-1、10-2、10-3g/ml),另外设阳性(顺铂)对照组、阴性对照组(含同一细胞密度的培养液)、溶剂对照组(7.5%甘油)。采用RPM1640培养液，含青霉素钠、链霉素各100 U/ml，10% FCS(56℃灭活30 min)，调节pH至7.2;对数生长期细胞(细胞为5×105 个/mi)100 μl接种于96孔板，37℃饱和湿度，5% CO2条件下，培养4 h，待细胞均已贴壁后加入100 μl不同剂量的受试物，各设5个复孔。

　　1.2.2MTT分析法分别于24、48、72 h取出96孔板，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml) 20 μl，37℃ 继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，然后选择490 nm，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD)，并记录结果。

　　1.3统计学处理数据采用SPSS12.0统计软件进行处理，各组间比较采用单因素方差分析和t检验,检验水准α=0.05。

　　2结果

　　2.1细胞形态学观察倒置显微镜下,阴性对照组人肝癌瘤细胞QCY-7404接种24 h，细胞约为孔底40%~50%满，接种48 h约为70%~80%满，72 h时约占90%~98%满，说明肿瘤细胞接种量适宜，细胞大量增殖、生长旺盛。细胞轮廓清晰完整(图1-a);阳性(顺铂)对照组细胞数量少，间距大，多数细胞体积固缩变小(图1-b)。人肝癌瘤细胞，在各种高剂量受试物作用下均呈现不同程度的抑制,特别是野蔷薇、黑加仑高剂量组细胞出现破碎和皱缩，边界模糊，透光度差;缺少立体感;细胞数量少，间距大，多数细胞体积固缩变小(图1-c)，野蔷薇、黑加仑低剂量组肿瘤细胞由于生长增殖受到一定的抑制,细胞密度低于阴性对照组,细胞散在,体积缩小,缺少立体感且有个别的破碎细胞聚集(图1-d);中剂量结果介于高、低剂量之间。

　　a: 阴性对照组b: 顺铂对照组c: 野蔷薇高剂量组d: 野蔷薇低剂量组

　　图1植物提取物对QCY-7704细胞的干预(略)

　　2.2不同浓度的各受试物对人肝癌瘤细胞QCY-7704的抑制作用野蔷薇、黑加仑、沙枣和巴旦杏提取物的抑制作用随剂量升高而加强;野蔷薇和黑加仑的抑瘤作用随作用时间的延长而加强;沙枣和巴旦杏的抑瘤作用与时间没有依赖关系(表1)。

　　3讨论

　　肿瘤是人类健康的第一杀手,从植物中开发抗肿瘤成分是目前抗肿瘤研究的热点之一。新疆地域广阔，植物资源丰富，野蔷薇、黑加仑 、沙枣、巴旦杏在新疆分布广泛。本实验通过不同浓度野蔷薇、黑加仑 、沙枣、巴旦杏提取物体外和人肝癌细胞作用，运用MTT法测量OD值并观察细胞形态变化，初步筛选抗癌药物。

　　表1不同浓度受试物对人肝癌瘤细胞的抑制作用(略)

　　注：与阴性对照组比较, *P<0.05, **P<0.01

　　本实验结果表明,野蔷薇、黑加仑、沙枣和巴旦杏提取物高剂量对人肝癌细胞株QCY-7404的增殖具有明显的抑制作用。此结果与有关研究报道野蔷薇、黑加仑 、沙枣、巴旦杏具有增强机体免疫力、抗突变、抗肿瘤作用相一致[3~6]。特别是野蔷薇和黑加仑组，人肝癌瘤细胞出现破碎和皱缩，边界模糊，透光度差;缺少立体感;细胞数量少，间距大，多数细胞体积固缩变小等现象而且剂量越大，作用时间越长，形态学改变越明显，此结果在 MTT分析中得到进一步证明。贴附是贴壁细胞生长增殖的重要条件之一，通常细胞表面有由细胞分泌的糖蛋白膜，它对细胞运动尤其是贴附支持物生长有重要作用，改变细胞外衣的性质可抑制其贴附，使细胞由支持物上脱落下来[7]。MTT法是广泛用于体外肿瘤药敏的测定常用方法。正常活细胞线粒体内活性脱氢酶可将MTT还原为紫色的甲潜(formazan)，且细胞的存活数与其产生的甲潜的OD值之间存在线性关系。各受试物组肿瘤细胞生长受抑制，OD值明显低于阴性对照组。野蔷薇、黑加仑、沙枣和巴旦杏提取物可能通过干扰细胞代谢、改变细胞外衣的性质来抑制肿瘤细胞增殖。野蔷薇、黑加仑、沙枣和巴旦杏提取物抑制人肝癌细胞株QCY-7404的有效成分和作用机理，还有待进一步研究。

　　【参考文献】

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　　[2]王贞丽，姜自彬，钱月中.植物抗肿瘤活性成分研究进展[J].前卫医药杂志,1999 ,16(1)：62-63 .

　　[3]封春玲，张月明，张卫东,等.野蔷薇果汁抗癌作用的初步研究[J].癌变·崎变·突变，1991，3(2)：133-134 .

　　[4]卢晓梅，张亚楼，张琰,等.新疆天然植物黑加仑对食管癌细胞增殖、凋亡的影响[J].营养学报,2005，27(5)：414-416 .

　　[5]马瑜红.沙棘的有效成分及药理研究进展[J].四川生理科学杂志,2005,27(2) ：75-77 .

　　[6]多力坤·买买提玉素甫,阿不都拉·阿巴斯,门进,等.巴旦杏仁对小白鼠PCE抗诱变活性的探讨[J].干旱区研究,2004,21(1):90-92 .

　　[7]鄂征.组织培养及分子生物学技术[M].北京：北京出版社,1995.15-20.