小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养

　　【摘要】 目的：观察原代培养的小鼠乳鼠心肌细胞的形态特征。方法：Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶消化心脏组织,差速贴壁分离法。结果：12 h心肌细胞基本贴壁，第2天可长成单层，第3~4天细胞伸出伪足相互接触交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，搏动呈同步性，收缩明显有力，搏动频率为30~120次/min。结论：用Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶分离培养小鼠乳鼠心肌细胞可获得形态、活力良好的心肌细胞。

　　【关键词】 乳鼠 心肌细胞 培养

　　The primary cultures of newnatal rat of mouse cardiacmyocytes

　　Najina, WANG Ling-peng, MA Yan, et al

　　(Cardiorascular Center, First Affiliated Hospical, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)

　　Abstract: Objective: To observe the morphological characteristics of the cultured cardiomyocytes. Methods: The hearts were digested by collagenase type Ⅱ, trypsin and D Nase Ⅰ. The cell suspension was preplated to reduce the fibroblast content. Results: The cells spread over the first day and developed their characteristic morphology by day 3 or 4. They were arranged in loose and interlacing networks of single cells. The cells beat spontaneously at 30~110 per minute. Conclusion: It can obtain cardiomyocytes with well morphology and spontaneous beating with collagenase type Ⅱ, trypsinandDNase Ⅰ.

　　Key words: newnatal rat; cardiomyocytes; culture

　　心肌细胞培养已成为心血管研究的基本方法和手段之一，目前在心肌细胞的生长发育、生理、代谢、病理、药理等方面已开展了多项基础研究。其中体外培养的心肌细胞可保持结构及功能上的某些特点,并具有自发性节律搏动,且心肌细胞的培养具有简便、定量、重复性好以及不受神经体液因素的影响等特点。利用培养的心肌细胞在探索非血液动力学因素所致的心肌肥厚的调节,研究心肌细胞的生物力学、凋亡、受体下调、缺血预处理、信号通路、对作用于心脏的新药进行筛选并对其安全性进行评价以及从培养的心肌细胞中提取有价值的生物因子等方面具有广阔的应用前景,故引起了人们的高度重视并竞相进行与心肌细胞培养有关的研究[1]。心肌细胞培养的常见动物是大鼠,常用的细胞培养方法包括新生大鼠心肌细胞的培养和成年大鼠细胞的培养。为观察原代培养小鼠乳鼠心肌细胞的形态特征，本研究用Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶分离培养小鼠乳鼠心肌细胞。现将小鼠乳鼠心肌细胞培养方法介绍如下。

　　1材料与方法

　　1.1动物和主要试剂10窝出生后3 d以内的小鼠乳鼠(昆明种小白鼠)。每窝乳鼠为(12.5±2.21)只，雌雄不限(新疆医科大学实验动物中心提供),DMEM/F12培养基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS Gibco公司)，Ⅰ、Ⅱ型胶原酶(Gibco)，胰蛋白酶(北京拜尔迪生公司)。

　　1.2心肌细胞培养

　　1.2.1方法手持小鼠乳鼠，750 ml/L乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有DF培养基的大皿中，后转入超净台中操作。将心脏表面附着的大血管剪去，将心脏置于另一大培养皿，用DF培养基清洗心脏，并在该溶液中将心肌组织剪成1~3 mm3大小的碎块,将小碎块移入三角烧瓶中，再加入0.25%胰蛋白酶10~15 ml并放在温控磁力搅拌器上磁力消化15 min(37℃100 r/min,离心10 min)，消化完毕，用吸管轻吹打，静置2 min，自然沉淀，弃上清，重复2次。上清液移入无菌离心管中，用培养液(含20%FBS，1%L-glutamine,青霉素及链霉素)终止胰蛋白酶消化，上清液移入另一离心管(内有培养液2~3 ml)至10 ml处，1 000 r/min 离心5 min，弃上清液(细胞沉淀用100 ml/LFBS的培养基制成CS悬液)以洗去残存胰蛋白酶，移入另一试管中，盖上无菌帽，置于冰待用，重复上述步骤3~5次(一般调节CS液浓度为10×105/ml即可培养出单层成片细胞，但具体细胞浓度要根据培养目的不同来调节)直至组织块消化完毕。

　　1.2.2心肌细胞计数在各次消化所得的细胞沉淀中加入培养液，集中混匀制成悬液，进行细胞计数，用吸滴管吸取细胞悬液少许，弃去第1滴后滴于血细胞计数板上，计测细胞数，细胞密度为5×105个/ml。细胞悬液可分装于培养瓶及培养皿内，置于37℃ 50 ml/L CO2培养箱中培养2 h，非心肌细胞贴壁速度较快，首先附在瓶底，心肌细胞仍处于悬浮状态，再将细胞悬液接种于50 ml培养瓶中。第2天换为含0.1 mmol/L Brdu的培养基培养3 d，以抑制非心肌细胞增殖，然后换为常规培养基培养，每2~3天换液1次。

　　2结果

　　倒置相差显微镜观察：刚分离的心肌细胞呈球形，培养4 h后细胞开始贴壁生长，呈现圆形，后变为梭形，细胞在瓶壁不断展开，伸出伪足，变为不规则形;12 h细胞基本贴壁，少数贴壁的单个细胞出现自发性搏动，搏动频率及节律不同;第2天可长成单层，第3~4天细胞伸出伪足相互接触交织成网，逐渐形成细胞簇或细胞单层，成放射状排列，搏动呈同步性，收缩明显有力，搏动频率一般在30~120次/min。培养心肌细胞在3~15 d时细胞形态及细胞活力都保持良好状态，到第16天时心肌细胞活力开始下降，并且心肌细胞形态开始皱缩，细胞簇周围有部分脱落，搏动频率开始降低。第18 d大部分细胞搏动停止，心肌细胞胞浆出现空泡和粗大颗粒样物质，细胞皱缩、脱落。

　　3讨论

　　自1960年Harary[2]首次对Wistar乳鼠的心肌细胞进行培养,并成功地维持其自发性节律搏动长达40 d以来,国内外诸多学者致力于心肌细胞培养的研究,开展了心肌细胞的生长发育、生理、代谢、病理、药理等方面的基础研究。培养心肌细胞的优点：可对长期接触的药物和其他因素进行研究;可在不受神经体液因素的影响下,就心肌细胞对药物和其他因素的反应进行直接观察;纯化的心肌细胞均一性好,特别适用于进行生物化学方面的研究;采用显微镜可直接观察其他因素对心肌活细胞的收缩活动的影响;培养的心肌细胞易于固定,亦适用于进行电镜观察研究;由于可用人的胎儿心肌细胞进行培养,故排除了种属间的差异;培养的心肌细胞具有同神经介质激素药物等作用的受体功能,此外其细胞膜的电特征(动作电位及静息电位)也类似于整体心脏;在离子通道研究中,对整体细胞电压钳技术测量宏观电流以及斑片钳技术测量单一通道电流来说均为一好模型;心肌细胞培养,对于探索非血液动力学因素所致的心肌肥厚的调节以及研究心肌细胞的生物力学、凋亡、受体下调、缺血预处理等来说也均为一可靠的工具;利用心肌细胞培养尚可对作用于心脏的新药进行筛选并对其安全性进行评价以及有可能从培养的心肌细胞中提取有价值的生物因子[3]。本实验用小鼠乳鼠心肌细胞进行培养，使心肌细胞搏动持续时间18 d。一般在心肌细胞融合成细胞簇或细胞单层、细胞形态和活力良好的情况下进行各种实验，并且持续搏动18 d可保证实验顺利完成。18 d后心肌细胞停止搏动。赫亚荣等[3]认为心肌细胞停止搏动是因为心肌细胞必须在工作条件下才能保持其原有的结构和功能，培养心肌细胞由于没有工作负荷，所以较快萎缩，细胞内肌丝、线粒体及微管减少，长期培养的心肌细胞几乎失去原有心肌细胞特征。Thompson[4]证实当施加负荷后，萎缩心肌细胞可恢复原有心肌细胞的结构和功能。因此，培养1周以内的心肌细胞最适合各种实验研究[5]。再者，非心肌细胞增殖快于心肌细胞，非心肌细胞影响心肌细胞搏动频率和细胞形态，促使心肌细胞失去固有特性[6]。因此，纯化心肌细胞对于维持心肌细胞正常形态和延长心肌细胞自发搏动时间至关重要。本实验结果还显示小鼠乳鼠培养的心肌细胞形态及活力，与国内诸多实验室进行大鼠乳鼠培养的心肌细胞形态及活力相似，小鼠乳鼠相对经济，且小鼠繁殖周期为18 d,较大鼠明显短。因此，培养心肌细胞有很多的优点，目前已应用于相关学科一些前沿问题的研究,实验证明它是从细胞和分子水平反映实验效果的一个很好的模型。但仍存在一些问题，如细胞存活率低、纯度不高等，有待进一步摸索及改进。

　　【参考文献】

　　[1]郝亚荣,李建军. 乳鼠心肌细胞的原代培养[J]. 心脏杂志, 2001,13(6):473-475.

　　[2]Harary L, Farley B. In vitro studies of single isolated beating heart cells[J]. Science,1960,131:1674-1675.

　　[3]郝亚荣,李庚山. 乳鼠心肌细胞培养[J].岭南心血管病杂志,2001 ,7(2):137-139.

　　[4]Thompson EW. Atrophy reversal and cardiocyte redifferentiation in reloaded cat myocardium[J].Circ Res,1984,54:367-373.

　　[5]Piper HM, Probst I, Schwart ZP, et al. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes[J].J Mol Cell Cardiol,1982,14:397-402.

　　[6]董丰,龚开政. 原代心肌细胞培养方法的探讨[J]. 大连医科大学学报, 2001, 23(4):307-308.