淫羊藿总黄酮对MPP+诱导MES23.5细胞损伤保护作用

　　【摘要】 目的探讨淫羊藿总黄酮对1-甲基-4-苯吡啶离子(MPP+)诱导的MES23.5细胞损伤的保护作用。方法MES23.5细胞常规培养，淫羊藿总黄酮预处理24 h，再用MPP+和淫羊藿总黄酮共同处理细胞24 h，MTT法检测细胞的存活率，实时反转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)观察bcl-2和bax基因的表达情况。结果MPP+可剂量依赖性地损伤MES23.5细胞(F=18.38，P<0.001);淫羊藿总黄酮预处理可明显对抗MPP+的毒性作用 (F=44.36，P<0.001);MPP+对bcl-2基因表达没有明显影响，但可明显增加bax基因的表达(F=10.92，P<0.05);淫羊藿总黄酮预处理可明显增加bcl-2基因的表达(F=15.76,P<0.01)，并可逆转bax基因表达的增高(F=10.92，P<0.05)。结论淫羊藿总黄酮可明显对抗MPP+对MES23.5神经细胞的损伤，其作用机制可能与抗凋亡有关。

　　【关键词】 淫羊藿总黄酮;1-甲基-4-苯吡啶离子;细胞凋亡;MES23.5细胞

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo study the protection of total flavonoid of Herba Epimedii (TFHE) against 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+)-induced neurotoxicity.MethodsMES23.5 cells were cultured as routine and pretreated with TFHE for24 h, and then co-treated with MPP+ and TFHE for 24 h. The survival of the cells was observed by MTT method. The real time RT-PCR was used to detect the gene expressions of bcl-2 and bax.ResultsMPP+ damaged MES23.5 cells as a dose-dependent manner (F=18.38,P<0.001). Pretreatment with TFHE could obviously against toxic action of MPP+ (F=44.36,P<0.001). MPP+ had no significant effect on bcl-2 gene expression, but increased the gene expression of bax (F=10.92,P<0.05). Pretreatment of TFHE increased the bcl-2 gene expression (F=15.76,P<0.01) and reversed the increase of bax gene expression(F=10.92,P<0.05).ConclusionTotal flavonoid of Herba Epimedii has an antagonistic action on MES23.5 cells damage induced by MPP+, of which, the mechanism may be related to its anti-apoptosis effects.

　　[KEY WORDS]total flavonoid of Herba Epimedii; 1-methyl-4-phenylpyridinium; apoptosis; MES23.5 cells

　　帕金森病(PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，PD的主要病理改变是中脑黑质致密带(SNpc)多巴胺能神经元进行性脱失并伴发黑质纹状体轴突末梢多巴胺耗竭[1-2]。PD的病因迄今未明，发病机制十分复杂，可能有多种因素参与，其中氧化应激和细胞凋亡在PD的发病中具有重要的作用。目前，尚无成熟有效的药物或方法能阻止或逆转PD病情的发展。因此，探索并研制开发有效的防治PD的药物成为当今医药界研究的热点。淫羊藿 (Herba Epimedii)，又名仙灵脾，为我国传统的补肾壮阳中药，历代本草药典均有记载。淫羊藿主要化学成分为黄酮类化合物、木脂素及生物碱，其中黄酮类化合物是淫羊藿主要的药理活性组分。研究表明，淫羊藿具有多方面的药理作用，主要集中在免疫系统、生殖系统、骨骼系统、核酸代谢、心脑血管系统及抗衰老等方面[3-6]。其中对神经系统，有报道淫羊藿提取物可以改善脑缺血和脑低氧;抗抑郁;可以通过调节中枢神经递质水平及酶的代谢，改善学习记忆，延缓脑组织衰老。但是淫羊藿总黄酮对黑质多巴胺能神经元的保护作用及其作用机制的研究，目前尚未见报道。鉴于传统中药作用的多靶点特性，我们推测淫羊藿总黄酮可以对抗神经毒性物质对多巴胺能神经元的损伤。本研究应用1-甲基-4-苯吡472啶离子(MPP+)损伤MES23.5神经细胞，建立PD细胞模型，研究淫羊藿总黄酮的神经保护作用，以期为PD的防治提供进一步的实验依据。

　　1材料与方法

　　1.1试剂及其来源

　　淫羊藿总黄酮由深圳中药及创新药物研究中心提供; DMEM/F12培养基购自Invitrogen公司(美国);PCR逆转录试剂盒购自Promega公司(美国);SYBR Green购自Bio Rad公司(美国);噻唑蓝(MTT)和胎牛血清均购自Gibco BRL公司;其余均为AR级;MES23.5细胞由乐卫东教授(美国贝勒医学院)提供。

　　1.2细胞培养及药物处理

　　MES23.5细胞接种于96孔板或6孔板，用含体积分数0.05牛血清及Sato成分的DMEM/F12培养基于37 ℃、含体积分数0.05 CO2条件下培养。细胞汇合达80%~90%时，分为对照组(A组)、MPP+组(B组)、淫羊藿总黄酮+ MPP+组(C组)。

　　1.3MTT法检测细胞生长

　　将传代细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为3×103个。当细胞均匀贴壁生长时，采用MPP+处理细胞24 h，或淫羊藿总黄酮预处理细胞24 h后，再采用MPP+处理24 h后去除培养液，加5 g/L的MTT溶液20 μL，于37 ℃含体积分数0.05 CO2培养箱继续培养4 h。每孔加入DMSO溶液100 μL，混匀后用酶标仪检测570 nm处的吸光度(A)值，计算细胞存活率。

　　1.4实时反转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)检测bcl-2和bax基因的表达

　　将传代细胞接种于6孔板中，用MPP+处理细胞24 h，或淫羊藿总黄酮预处理细胞24 h后，再用MPP+处理细胞24 h，采用Trizol法从细胞中提取总RNA，取1 μg总RNA进行逆转录。采用SYBR Green染料法相对定量检测bcl-2、bax和GAPDH　　的基因表达。bcl-2上游引物序列为5′-CCTGTGG-ATGACTGAGTACC-3′;下游引物序列为5′-CCCA-　　CTCGTAGCCCCTCT-3′。bax上游引物序列为5′-GGCGAATTGGAGATGAAC-3′;下游引物序列为5′-CCGAAGTAGGAGAGGAGG-3′。GAPDH上游引物序列为5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′;下游引物序列为5′-CCCTGTTGCTGTAGCCGTA-T-3′。用未处理的样本做标准曲线，计算出靶基因的含量，并与内参基因GAPDH相比。

　　1.5统计学分析

　　计量资料以±s表示，应用GraphPad Prism 5.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)并继以Tukey法进行两两比较。

　　2结果

　　2.1不同浓度MPP+对MES23.5细胞的毒性作用及淫羊藿总黄酮的保护作用

　　MES23.5细胞经0、10、50、100、200及400 μmol/L的MPP+处理24 h，细胞存活率分别为1.000±0.019、0.983±0.065、0.797±0.055、0.753±0.081，0.689±0.080及0.580±0.110。MPP+可剂量依赖性地降低MES23.5细胞的存活率(F=15.03，P<0.001)。用0.25 mg/L淫羊藿总黄酮预处理细胞24 h，可明显降低100 μmol/L MPP+毒性作用(F=44.36，q=4.284,P<0.001)。见表1。

　　2.2淫羊藿总黄酮对MPP+诱导的bcl-2基因表达的影响

　　100 μmol/L MPP+ 处理细胞24 h,可引起bcl-2基因表达的轻微降低，但差异没有统计学意义。应用0.25 mg/L淫羊藿总黄酮预处理细胞24 h后，可明显增加bcl-2基因的表达，与A、B组相比，差异有极显著意义(F=15.76，q=6.112、7.445,P<0.05、0.01)。见表1。

　　2.3淫羊藿总黄酮对MPP+诱导的bax基因表达的影响

　　100 μmol/L MPP+可明显增加bax基因的表达，而应用0.25 mg/L淫羊藿总黄酮预处理后，bax基因的表达较B组明显降低(F=10.92,q=5.842,P<0.05)。见表1。表1淫羊藿总黄酮预处理对MPP+诱导的MES23.5细胞存活率、bcl-2和bax基因表达的影响

　　3讨论

　　PD是中枢神经系统退行性疾病，是国际亟待攻克病因及治疗的老年性疾病。研究显示，MPP+能够增加氧化应激、诱导细胞凋亡，是公认的可以诱发多巴胺能神经元变性的神经毒素[7]。MES23.5细胞是一种杂交瘤性多巴胺能神经元细胞系,是由大鼠的胚胎中脑细胞与小鼠神经母细胞瘤-胶质瘤细胞系N18TG2杂交而成，可替代原代培养的多巴胺神经元用于研究神经变性疾病PD[8]。本文应用MPP+损伤细胞MES23.5这一多巴胺能神经元细胞系，研究淫羊藿总黄酮的神经保护作用及其机制。

　　淫羊藿作为一种药用植物，已有2 000多年的应用历史，淫羊藿中黄酮类化合物是其主要化学成分，具有多种药理活性。本研究的结果显示，MPP+可剂量依赖性降低MES23.5细胞的存活率，提示MPP+对MES23.5细胞具有毒性作用。应用淫羊藿总黄酮预处理后，可明显提高细胞的存活率，表明淫羊藿总黄酮对MES23.5细胞具有保护作用，可以对抗MPP+的毒性作用。

　　线粒体的功能是受Bcl-2蛋白家族调控的[9-10]。抗凋亡蛋白Bcl-2分布在线粒体外膜，具有稳定线粒体膜的作用，保护线粒体的完整性，阻止细胞色素C的释放，从而发挥其抗凋亡作用;而Bax作为一种胞浆蛋白，可以从胞浆易位到线粒体，整合入线粒体外膜膜外侧，增加其通透性，诱导细胞色素C释放，进而导致细胞凋亡。MPP+作为一种神经毒素，可以通过抑制线粒体电子传递链复合物Ⅰ、调控Bcl-2蛋白家族的表达及促进活性氧(ROS)的释放等多种途径，诱导细胞凋亡。本研究结果显示，MPP+处理细胞24 h，可以明显增加bax基因的表达，而bcl-2基因的表达仅有轻微降低，结果表明在本实验条件下MPP+主要是通过诱导bax的基因表达，而促进MES23.5细胞凋亡。淫羊藿总黄酮预处理组bcl-2基因的表达可明显升高，而bax基因的表达则明显降低，揭示淫羊藿总黄酮通过调控bcl-2和bax的基因表达，发挥其抗凋亡作用。有研究表明，bcl-2基因的编码区含有雌激素反应元件，我们的前期实验证实，淫羊藿总黄酮主要活性成分淫羊藿苷具有类激素样作用[11]。淫羊藿总黄酮对bcl-2基因的调控，可能与其类激素样特性有关[11]。

　　综上所述，本研究首次揭示淫羊藿总黄酮可明显对抗MPP+对MES23.5细胞的毒性作用，其作用机制可能与抗凋亡有关。本研究结果为传统中药的新用途提供了直接的实验依据，为PD的治疗和预防提供了可能的干预措施。

　　【参考文献】

　　\[1\]DAWSON T M, DAWSON V L. Molecular pathways of neurodegeneration in Parkinson’s disease\[J\]. Science, 2003,302(5646):819-822.

　　\[2\]HAOBAM R, SINDHU K M, CHANDRA G, et al. Swim-test as a function of moto impairment in MPTP model of Parkinson’s disease: a comparative study in two mouse strains\[J\]. Behav Brain Res, 2005,163(2):159-167.

　　\[3\]ZHANG G, QIN L, SHI Y. Epimedium-derived phytoestrogen flavonoids exert beneficial effect on preventing bone loss in late postmenopausal women: a 24-month randomized, double-blind and placebo-controlled trial\[J\]. J Bone Miner Res, 2007,22(7):1072-1079.

　　\[4\]XIE F, WU C F, LAI W P, et al. The osteoprotective effect of Herba epimedii (HEP) extract in vivo and in vitro\[J\]. Evid Based Complement Alternat Med, 2005,2(3):353-361.

　　\[5\]YAN F F, LIU Y, LIU Y F, et al. Herba Epimedii water extract elevates estrogen level and improves lipid metabolism in postmenopausal women\[J\]. Phytother Res, 2008,22(9):1224-1228.

　　\[6\]肖幸丰,王志强,楼宜嘉. 淫羊藿苷伍用三七总皂苷对小鼠免疫功能的调节作用\[J\]. 中草药, 2006,3(6):233-236.

　　\[7\]LEE D Y, LEE K S, LEE H J, et al. Kynurenic acid attenuates MPP+-induced dopaminergic neuronal cell death via a Bax-mediated mitochondrial pathway\[J\]. Euro J Cell Bio, 2008,87(6):389-397.

　　\[8\]王明波,陈文芳,谢俊霞. 人参皂苷Rg1对6-OHDA所致MES23.5神经细胞损伤的保护作用\[J\]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(5):377-378,381.